1.3.3.2質(zhì)譜測定

將酶解好的樣品用MALDIＴO(shè)F/ＴO(shè)F質(zhì)譜儀（美國AppliedBiosystems）對樣品進(jìn)行測定，選擇合適的儀器參數(shù)獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)至少為3次平行試驗的平均值。采用Origin9.0繪圖，SPSS19.0進(jìn)行顯著性檢驗，P＜0.01為極顯著，P＜0.01為極顯著，多重比較采用Duncan檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1鰱魚肌原纖維蛋白降解過程中的2-DE圖譜

如圖1所示，隨著降解過程的進(jìn)行，0h時處理組蛋白點均較少，4℃-1h和25℃-0.5h時，蛋白點增多，同時低分子蛋白區(qū)出現(xiàn)蛋白點，表明肌原纖維蛋白被降解成小分子多肽或蛋白質(zhì)。隨后，在4℃-2h和25℃-1h時，蛋白點變得模糊，并發(fā)生拖尾等聚焦不徹底的情況。這可能是由于降解過程中蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集和氨基酸改性所致。

利用PDQuest軟件對4℃處理0，1，2h及25℃處理0，0.5，1h樣品的2-DE圖譜進(jìn)行重復(fù)性和匹配率的檢測，對2-DE圖譜蛋白點表達(dá)差異進(jìn)行比較分析。差異蛋白點檢測標(biāo)準(zhǔn)為：若某一個蛋白點在不同組之間的相對豐度的比值大于2，且t-testP＜0.05，即認(rèn)為該點為差異蛋白點。經(jīng)過分析得到，4℃組和25℃組分別存在45個、30個差異蛋白質(zhì)點，如圖4所示。差異蛋白點的局部放大圖如圖2及圖3所示。

2.2差異蛋白點質(zhì)譜鑒定及分析

在對如圖4所示的總計75個差異蛋白質(zhì)點割膠取點的過程中，刪除掉4和25℃重復(fù)的點，以及割膠失敗的點，共獲得獨立可進(jìn)行質(zhì)譜鑒定的蛋白質(zhì)點24個。其中4℃組中共有14個蛋白點，分別是點3504，0510，6406，3413，1005，1105，1410，0014，1012，0007，6512，5506，0116，6407；25℃組中共有10個蛋白點，分別是2402，2304，5302，5104，2204，4108，0214，5503，5504，2203。對割膠成功的24個蛋白質(zhì)點進(jìn)行膠內(nèi)酶切后質(zhì)譜鑒定，得到24個蛋白點的肽指紋圖譜。

2.3差異蛋白質(zhì)的功能分類

2.3.1差異蛋白質(zhì)的細(xì)胞組成分類

表5列出的Level9級別的差異蛋白質(zhì)的細(xì)胞組成分類，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)主要以骨架結(jié)構(gòu)部分（cytoskeletalpart）為主。收縮纖維部分（contractilefiberpart）及肌原纖維（myofibril）各自包含1個蛋白點，為點3504；中間絲骨架（intermediatefilamentcytoskeleton）包含2個蛋白質(zhì)，分別為點5504及6407；肌動蛋白骨架（actincytoskeleton）包含4個蛋白點，分別為3504，5503，5506，6512；骨架結(jié)構(gòu)部分（cytoskeletalpart）包含6個蛋白點，分別為3504，5504，6407，5503，5506及6512。表明在降解過程中，主要是肌原纖維蛋白的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞。Ayala等發(fā)現(xiàn)鯛魚在0℃貯藏期間肌原纖維蛋白降解速度非?？欤渲兄饕羌?xì)胞骨架蛋白被降解。

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