板栗屬殼斗科栗屬堅(jiān)果類植物，在世界范圍內(nèi)被作為重要的農(nóng)作物之一。板栗深加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的板栗殼仍以燃燒和自然腐爛等方式處理，這樣既造成了資源浪費(fèi)也不利于環(huán)保。據(jù)資料顯示，板栗殼中含有色素、有機(jī)酸、多酚類、多糖(或苷類)和鞣質(zhì)等化學(xué)成分。板栗殼的多酚類物質(zhì)主要組分為單寧，而單寧的種類包括很多，其中具有抗氧化活性結(jié)構(gòu)的主要成分為鞣花單寧和原花青素。人體內(nèi)的自由基過(guò)剩會(huì)引起多種疾病，包括心血管疾病、白內(nèi)障、阿爾茨海默氏癥等，但是體內(nèi)的內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)不足以防御細(xì)胞損傷，所以從食物資源中尋找天然抗氧化劑已成為研究熱點(diǎn)。有研究表明板栗殼原花青素具有抵御自由基、抑菌殺菌等作用，可以廣泛應(yīng)用于食品及調(diào)味品行業(yè)。丁培峰研究了茶多酚在醬油中的防腐效果，結(jié)果顯示，茶多酚與納他霉素復(fù)配使用后與山梨酸鉀具有等同的防腐效果，且安全性大大提升。同時(shí)，茶多酚具有一定的保健功效，可提高醬油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能。

多酚類物質(zhì)雖然具有多種生理活性和延長(zhǎng)調(diào)味品保質(zhì)期的效果，但是外界條件也會(huì)影響其穩(wěn)定性，從而降低它的生理活性，且人體中的胃液及腸道消化液也會(huì)對(duì)多酚的活性產(chǎn)生影響。例如，提取自姜黃根莖的多酚類化合物姜黃素的藥理作用廣泛，毒性小，并且長(zhǎng)期以來(lái)作為調(diào)味品和食品添加劑在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，但是，由于其生物利用度低顯著影響其應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)板栗殼原花青素的研究主要在抗氧化性及提取優(yōu)化等方面，對(duì)其作為調(diào)味品功能性添加劑的開(kāi)發(fā)以及其在人體中的消化吸收研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)探究影響板栗殼粗提物中原花青素穩(wěn)定性的因素，利用HPLC-MS研究其種類并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，同時(shí)通過(guò)人體體外消化模型研究其消化情況，為板栗殼中天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)及其在食品和調(diào)味品方面的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與試劑

板栗：取自山東祁蒙山。

香草醛、α-淀粉酶、膽汁提取物、胰蛋白酶、胃蛋白酶：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品表兒茶素、沒(méi)食子酸、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯以及表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

2、儀器與設(shè)備

TG16-WS離心機(jī)長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；UV-1800紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)上海美諾達(dá)儀器有限公司；pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Agilent1100LC-MSD/TOF高分辨液相質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)安捷倫科技公司。

3、試驗(yàn)方法

（1）板栗殼粗提物提取制備

將板栗殼洗凈晾干，粉碎過(guò)40目篩得到板栗殼粉末。參考蘇云霞等研究得到的最佳提取工藝，取適量板栗殼粉末加入70%乙醇水溶液，使料液比為1∶15(g/mL)，在65℃的條件下提取90min，再將提取液進(jìn)行真空抽濾，濾液在40℃下真空濃縮，再次冷凍干燥，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）板栗殼粗提物中原花青素穩(wěn)定性影響因素研究

①板栗殼原花青素溶液的制備

稱取板栗殼粗提物0.1g，用蒸餾水定容至100mL，研究光照、溫度、金屬離子和pH對(duì)原花青素的影響。

②光照對(duì)板栗殼原花青素的影響

取10mL板栗殼原花青素溶液3份，分別置于室溫光照、室溫避光和低溫避光的條件下，放置4d，每隔1d取樣測(cè)定樣品溶液中原花青素含量(以保存率表示)；原花青素保存率=樣品待測(cè)時(shí)原花青素含量/樣品初始原花青素含量×100%。原花青素的測(cè)定方法采用硫酸-香草醛比色法。

③溫度對(duì)板栗殼原花青素的影響

取10mL板栗殼原花青素溶液6份，分別在40，50，60，70，80，90℃條件下恒溫水浴2h，原花青素含量測(cè)定方法同上。

④pH對(duì)板栗殼原花青素的影響

取10mL板栗殼原花青素溶液14份，用HCl和NaOH溶液配制成pH為1～14的溶液，將原花青素樣品與10mLpH為1～14的溶液混合，密封靜置6h，原花青素含量測(cè)定方法同上。

⑤金屬離子對(duì)板栗殼原花青素的影響

配制0.02mol/L含F(xiàn)e³⁺、Fe²⁺、Ba²⁺等金屬離子的溶液待用，再把不同金屬離子溶液與原花青素溶液等體積混合，密封放置一段時(shí)間，觀察溶液顏色變化。

（3）板栗殼原花青素結(jié)構(gòu)分析

用高效液相測(cè)定沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯6種標(biāo)準(zhǔn)品及板栗殼粗提物出峰時(shí)間，比較得出板栗殼粗提物中所含物質(zhì)，并對(duì)粗提物進(jìn)行高分辨質(zhì)譜結(jié)構(gòu)分析。

色譜條件：色譜柱為DIONEXC₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇(B)(體積分?jǐn)?shù)為0.05%)-三氟乙酸(A)，梯度洗脫：0～12min，A：87%～75%，B：13%～20%；12～23min，A：75%～20%，B：25%～80%；23～26min，A：87%，B：13%。流速：0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μL。

質(zhì)譜分析條件：色譜柱為L(zhǎng)ichrosphersC₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；質(zhì)譜進(jìn)樣分流比為1∶1；負(fù)離子模式；離子化方式：ESI；掃描范圍：m/z50～2000；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：15L/min；噴霧壓力：40psi；毛細(xì)管電壓：3500V。

（4）板栗殼原花青素的消化吸收

①消化體系的制備

胃液環(huán)境配制：在250mL燒杯中加入0.4g的胃蛋白酶、9mg/mL的氯化鈉溶液90mL混勻，再轉(zhuǎn)入100mL的容量瓶中，用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)使溶液pH為2～2.3，直至溶液至容量瓶刻度線。

腸道環(huán)境配制：在250mL燒杯中加入225mg的胰蛋白酶、225mg的膽汁提取物、9mg/mL的氯化鈉溶液90mL混勻，再轉(zhuǎn)入100mL的容量瓶中，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)使溶液pH為7～7.2，直至溶液至容量瓶刻度線。

②模擬胃液消化

設(shè)置5組平行試驗(yàn)和1個(gè)空白對(duì)照，每組平行實(shí)驗(yàn)條件如下：在50mL錐形瓶中依次加入中口腔消化液4mL、胃消化液16mL，于37℃、轉(zhuǎn)速為250r/min的搖床中震蕩反應(yīng)2h，每0.5h測(cè)1次pH值，通過(guò)測(cè)pH的變化可初步判斷原花青素是否消化；并在反應(yīng)時(shí)間為0.5，1，1.5，2h各取1mL消化液，測(cè)定原花青素的含量，并計(jì)算其消化率；消化率=(1-測(cè)得原花青素質(zhì)量/最開(kāi)始加入原花青素質(zhì)量)×100%。

③模擬腸道消化

設(shè)置5組平行試驗(yàn)和1個(gè)空白對(duì)照，每組平行實(shí)驗(yàn)條件如下：量取胃液消化液20mL，用氫氧化鈉中和到pH為7，終止胃液消化反應(yīng)；再加入20mL腸道消化液反應(yīng)2h，并在反應(yīng)時(shí)間0.5，1，1.5，2h各取1mL消化液測(cè)定原花青素的含量，并計(jì)算其消化率。

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