1.10 單糖或者多糖抑制實驗

用培養(yǎng)基配制終質(zhì)量濃度為1mg/mL的昆布糖培養(yǎng)液以及5mg/mL的甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及鹽藻糖培養(yǎng)液，取lmL上述含糖培養(yǎng)液和細(xì)胞共孵育30min之后，加入1mg的營養(yǎng)態(tài)酵母或1mg酵母孢子或200μg葡聚糖微球，離心后進(jìn)行吞噬實驗并且統(tǒng)計相對吞噬效率。

1.11 野生型孢子和突變體孢子吞噬實驗

取1mg的野生型酵母孢子、ditl△孢子和chs3△孢子，按照1.6方法進(jìn)行吞噬實驗。

1.12 統(tǒng)計分析

采用Graphprism軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析作圖，所有數(shù)據(jù)以平均值+標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素或雙因素方差分析(One-WavorTwo-WavANOVA)檢驗組間的差異。檢驗標(biāo)準(zhǔn)P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，每次實驗重復(fù)5次。對于本實驗統(tǒng)計結(jié)果，標(biāo)記如下：P≥0.05標(biāo)記為ns：0.01＜P＜O.05標(biāo)記為*；0.001＜P≤0.01標(biāo)記為**；P≤0.001標(biāo)記為***；P≤0.0001標(biāo)記為****。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨噬細(xì)胞內(nèi)吞野生型酵母孢子效率高于營養(yǎng)態(tài)酵母

營養(yǎng)態(tài)酵母壁和野生型酵母孢子壁的結(jié)構(gòu)有所不同.比較巨噬細(xì)胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的響應(yīng)，結(jié)果見圖1(a)。隨著營養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子質(zhì)量濃度的增加，巨噬細(xì)胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型孢子的數(shù)目呈上升趨勢。當(dāng)營養(yǎng)態(tài)酵母和孢子質(zhì)量均為lmg時，巨噬細(xì)胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和孢子的情形見圖l(b)。統(tǒng)計分析表明，此時每100個巨噬細(xì)胞吞噬酵母或孢子的個數(shù)分別為35個和320個。質(zhì)量為1mg時，酵母孢子個數(shù)約為營養(yǎng)態(tài)酵母個數(shù)的3.7倍，此時孢子被吞噬個數(shù)約為營養(yǎng)態(tài)酵母個數(shù)的9倍。這表明巨噬細(xì)胞對酵母孢子內(nèi)吞效率顯著高于營養(yǎng)態(tài)酵母。

2.2 巨噬細(xì)胞對酵母孢子的內(nèi)吞是依賴于Syk和P13K的吞噬過程

巨噬細(xì)胞對大顆粒微生物的內(nèi)吞主要是通過巨胞飲和吞噬過程。巨胞飲指的是細(xì)胞依賴于細(xì)胞膜流動性的非特異內(nèi)吞大顆粒過程；吞噬過程指的是免疫細(xì)胞膜上受體介導(dǎo)的并且依賴于Syk途徑的內(nèi)吞過程。已有的研究表明，巨噬細(xì)胞吞噬葡聚糖微球依賴于Syk，通過白皮杉醇抑制Svk能夠抑制巨噬細(xì)胞對葡聚糖微球的吞噬。利用Svk抑制劑白皮杉醇阻斷Svk所介導(dǎo)的信號通路見圖2(a)。與對照組相比，增加白皮杉醇的濃度會增強(qiáng)抑制巨噬細(xì)胞對葡聚糖微球、營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型孢子的吞噬作用。這表明巨噬細(xì)胞對野生型酵母孢子和酵母的內(nèi)吞途徑是依賴于Svk受體介導(dǎo)的吞噬過程。有研究表明，巨噬細(xì)胞吞噬較大顆粒依賴于P13K，配制不同濃度的渥曼青霉素測定其對巨噬細(xì)胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的影響。如圖2(b)所示，與對照組相比，渥曼青霉素對巨噬細(xì)胞吞噬酵母和葡聚糖微球無顯著影響；隨著渥曼青霉素質(zhì)量濃度的增加，其對巨噬細(xì)胞吞噬野生型酵母孢子的抑制作用增強(qiáng)。這表明盡管野生型孢子直徑小于營養(yǎng)態(tài)酵母.其吞噬途徑是極其依賴于P13K的過程.而營養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬過程不是顯著依賴于P13K的過程。因此，巨噬細(xì)胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的吞噬依賴Svk下游不同激酶，表明巨噬細(xì)胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和孢子所依賴的信號途徑不同。

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