2.3 巨噬細胞對野生型酵母孢子的吞噬不依賴于血清調(diào)理

為了探究巨噬細胞對酵母孢子識別是否依賴于血清中補體或抗體成分，檢測無血清培養(yǎng)基對吞噬野生型孢子效率的影響。如圖3(a)所示，每100個巨噬細胞于有、無血清情況下吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的個數(shù)分別為42、38和338、322，統(tǒng)計分析無顯著性差異，這表明巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母或野生型酵母孢子的吞噬不依賴于血清中補體和免疫球蛋白成分。圖3(b)顯示，無血清條件下攝入營養(yǎng)態(tài)酵母或野生型孢子的巨噬細胞占總細胞的比率分別為18％和83％，這表明巨噬細胞對野生型孢子有更高效的內(nèi)吞作用。因此，巨噬細胞對野生型孢子的吞噬不是依賴于血清中補體和抗體調(diào)理導致的間接吞噬.這種吞噬極有可能是孢子表面存在的物質(zhì)被巨噬細胞識別從而引起吞噬。

2.4 巨噬細胞吞噬酵母孢子的配體為共價結(jié)合到孢子壁的非蛋白質(zhì)成分

為了進一步探究孢子壁上何種物質(zhì)作為分子配體導致野生型酵母孢子的高效吞噬，通過高鹽洗滌除去吸附在野生型酵母孢子壁上的分子，利用蛋白酶處理孢子壁并比較其吞噬效率。如圖4所示，處理后的酵母孢子吞噬效率與對照組吞噬效率無顯著差異，這表明野生型孢子表面被巨噬細胞識別的主要配體不是吸附于二酪氨酸層的物質(zhì)。而是共價結(jié)合到二酪氨酸層的物質(zhì)，并且這種分子配體物質(zhì)不是蛋白質(zhì)。

2.5 巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母依賴于葡聚糖配體，而酵母孢子不依賴

微生物表面的糖鏈能夠被巨噬細胞所識別，從而引起吞噬俐。為了探究巨噬細胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子與糖鏈配體是否有關，通過一系列糖鏈作為配體競爭抑制劑。昆布糖(直鏈的葡聚糖)能夠抑制由于酵母葡聚糖配體引起的吞噬，因此選取昆布糖作為對照組。從圖5可知。昆布糖能夠顯著地抑制巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球的吞噬，但對野生型酵母孢子的吞噬無顯著影響。圖5表明，甘露糖、甘露聚糖、半乳糖、乳糖以及巖藻糖對營養(yǎng)態(tài)酵母以及野生型酵母孢子的吞噬均無顯著影響。因此巨噬細胞通過識別營養(yǎng)態(tài)酵母和葡聚糖微球上葡聚糖配體介導吞噬，但野生型酵母孢子表面被巨噬細胞識別的配體不是葡聚糖或甘露聚糖等糖鏈，巨噬細胞識別營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的配體不同。

2.6 巨噬細胞對野生型酵母孢子的識別依賴于二酪氨酸層結(jié)構

為了探究野生型孢子表面被識別的配體，比較巨噬細胞吞噬野生型酵母孢子(AN12D孢子)、dit1△孢子和shs3△孢子的效率。Dit1△菌株是野生型酵母敲除二酪氨酸層合成基因DITI后得到的菌株，因此dit1△孢子無二酪氨酸層。Chs3△菌株是野生型酵母敲除酵母孢子殼聚糖層合成基因CHS3后得到的菌株，因此chs3△孢子無殼聚糖層。由于二酪氨酸層的合成是依賴于殼聚糖層的存在，因此chs3△孢子也無二酪氨酸層的存在。統(tǒng)計每100個巨噬細胞吞噬野生型酵母孢子、dit1△孢子和chs3△孢子的個數(shù)，從圖6可知，巨噬細胞對野生型酵母孢子的吞噬效率顯著高于dit1△孢子和chs3△孢子。如圖6(b)所示。酵母dit1△孢子和chs3△孢子與野生型酵母孢子大小相似，但巨噬細胞對野生型孢子的吞噬更為高效，這表明巨噬細胞對野生型酵母孢子的高效吞噬不是因為其直徑小于營養(yǎng)態(tài)酵母，而是因為野生型酵母孢子壁最外層二酪氨酸層的存在使其能被巨噬細胞識別，從而介導吞噬的發(fā)生。
 

3 結(jié)語

釀酒酵母孢子形態(tài)對免疫細胞的作用未被詳細研究，作者通過比較巨噬細胞對營養(yǎng)態(tài)酵母和野生型酵母孢子的內(nèi)吞效率，發(fā)現(xiàn)野生型酵母孢子能夠更高效地被巨噬細胞內(nèi)吞。進一步研究表明：野生型酵母孢子和營養(yǎng)態(tài)酵母的內(nèi)吞是依賴于Svk的受體介導的吞噬作用，但野生型酵母孢子的吞噬相對于營養(yǎng)態(tài)酵母而言極其依賴P13K，這表明巨噬細胞吞噬野生型孢子和營養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬信號途徑也有所不同。營養(yǎng)態(tài)酵母的吞噬配體是葡聚糖，但野生型酵母孢子的吞噬不依賴于葡聚糖配體，其高效吞噬與野生型孢子壁二酪氨酸層有關。

本研究表明，巨噬細胞高效吞噬野生型酵母孢子是依賴于二酪氨酸層，對這種配體的分子研究讓我們能夠找到一種可利用的、作為載體的生物分子配體，可將外源物質(zhì)高效傳遞到巨噬細胞體內(nèi)，為日后開發(fā)一種無毒、高效的靶向巨噬細胞的生物介質(zhì)提供理論依據(jù)。

相關鏈接：酪氨酸，葡聚糖，殼聚糖，甘露糖

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