釀酒酵母是公認(rèn)的有益于人類的真菌，在營養(yǎng)條件充足的情況下它進(jìn)行有絲分裂，此時(shí)的酵母以營養(yǎng)態(tài)細(xì)胞狀態(tài)存在。但是，在碳源或氮源等營養(yǎng)條件匱乏的情況下，釀酒酵母為了傳宗接代，會(huì)進(jìn)行減數(shù)分裂，產(chǎn)4個(gè)孢子包裹于子囊中。營養(yǎng)態(tài)酵母細(xì)胞壁有兩層，分別是內(nèi)層葡聚糖層和外層的甘露糖蛋白層。酵母孢子壁有4層，從內(nèi)到外依次是甘露糖層、葡聚糖層、殼聚糖層和二酪氨酸層。二酪氨酸層是酵母孢子壁特有的結(jié)構(gòu)，其單體是由兩個(gè)甲基酪氨酸分子構(gòu)成。這種特殊的孢子壁結(jié)構(gòu)能幫助減數(shù)分裂后的細(xì)胞核抵御嚴(yán)酷的大自然環(huán)境，等待適宜的生長環(huán)境，從而發(fā)芽成長，再次成為營養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)，維持酵母的繁衍。

巨噬細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞的一種，能夠吞噬和降解外源顆粒以及微生物并激活免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞的吞噬過程依賴于細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體，該受體能夠識(shí)別微生物表面保守的分子模式并且激活受體上酪氨酸基序。被激活的ITAM序列進(jìn)一步招募脾酪氨酸激酶啟動(dòng)巨噬細(xì)胞的吞噬過程。Svk信號(hào)能夠激活諸如磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶等下游信號(hào)，從而增加吞噬效率。吞噬過程中，較大顆粒(＞2μm)吞噬依賴于P13K的活性。巨噬細(xì)胞對微生物表面分子模式的識(shí)別是啟動(dòng)直接吞噬的第一步。微生物表面的糖鏈結(jié)構(gòu)的特殊性使其被巨噬細(xì)胞所識(shí)別從而引起吞噬。

自然條件下，多數(shù)酵母處于營養(yǎng)細(xì)胞態(tài)。營養(yǎng)態(tài)酵母壁的葡聚糖成分能夠被巨噬細(xì)胞表面葡聚糖受體識(shí)別從而引起吞噬，促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的釋放，葡聚糖也能夠與細(xì)菌結(jié)合從而抑制細(xì)菌在胃腸道增殖從而達(dá)到抑菌的作用。營養(yǎng)態(tài)酵母壁的幾丁質(zhì)成分也能刺激巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α和IL-6，并且增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對假絲酵母的殺傷作用圈。營養(yǎng)態(tài)酵母壁上這些免疫活性物質(zhì)的存在使得營養(yǎng)態(tài)酵母作為飼料添加物能夠增強(qiáng)牛和豬的免疫力。
釀酒酵母雖為與人類共生的真菌，但目前其子囊孢子形態(tài)對免疫系統(tǒng)的作用很大程度上未知，酵母孢子的葡聚糖層被殼聚糖層和二酪氨酸層嚴(yán)密包裹。其免疫活性物質(zhì)未知。作者以小鼠RAW264.7細(xì)胞作為巨噬細(xì)胞模型，研究了巨噬細(xì)胞識(shí)別和吞噬酵母孢子的作用機(jī)制，為后續(xù)探究野生型酵母孢子免疫作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

作者使用高效產(chǎn)孢率的AⅣJ2D二倍體釀酒酵母菌株，以及ditl△和hs3△突變體菌株，均來自作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，相關(guān)信息見表1。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞，購自中科院菌種保藏庫，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，條件為5％CO2，37℃。

1.3 培養(yǎng)基

YPAD培養(yǎng)基：蛋白胨A10g，酵母提取物5g，腺嘌呤15mg溶解于450mL去離子水中，滅菌后加入50mL質(zhì)量濃度為20g/dL的葡萄糖混勻。固體培養(yǎng)基則加入瓊脂(Agar)10g一起滅菌，之后加入葡萄糖混勻，倒平板。

YPAce培養(yǎng)基：蛋白胨A20g，酵母提取物10g，腺嘌呤30mg，醋酸鉀10g溶解于lL去離子水中，高壓濕熱滅菌。
KAc培養(yǎng)基：稱取20gKAc溶于1L去離子水中，固體培養(yǎng)基加入20g的瓊脂粉，高壓滅菌，倒平板。

1.4 主要試劑和儀器

主要試劑有：DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，昆布糖(Sigma)，葡聚糖微球(Sigma)，PBS(生工)，胰蛋白酶(生工)，蛋白酶K(Sigma)，溶菌酶(Sigma)；主要儀器有：細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，離心機(jī)(Takara)，顯微鏡(日立)等。

1.5 酵母培養(yǎng)

酵母菌株于固體YPAD平板劃線培養(yǎng)3d后，用粗頭牙簽接種于5mLYPAD液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)接于100mL液體YPAD培養(yǎng)基培養(yǎng)3～5h，使酵母處于對數(shù)生長期并且0D₆₆₀為0.6～0.8，此時(shí)收集營養(yǎng)態(tài)酵母，用0.5％吐溫-20洗3次后再用去離子水洗3次，3000r/min離心，稱質(zhì)量備用。酵母孢子的制備：營養(yǎng)態(tài)酵母過夜培養(yǎng)后，取10mL轉(zhuǎn)接到200mL的YPAce培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h后離心轉(zhuǎn)移到2％KAc培養(yǎng)基后續(xù)培養(yǎng)2d；離心收集子囊酵母，當(dāng)產(chǎn)孢率大于95％時(shí)，離心收集菌體，PBS洗2次，加入5mL原生質(zhì)體溶液(1.2mol/L山梨醇，0.1mol/LPBS)和50μL(10OOOU/mL)溶菌酶，于25℃搖床處理3h；原生質(zhì)體溶液洗2次，去離子水洗2次，加入5mL去離子水超聲20min(45％功率，超聲5s，停2s)，用0.5％吐溫-20洗3次后再用去離子水洗3次。顯微鏡觀察孢子純化效果，將純化后孢子制備成100mg/mL的孢子懸液。

1.6 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)和吞噬實(shí)驗(yàn)

RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞置于含10％滅活牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，用含EDTA的胰酶消化后傳代。12孔板每孔接種5×10⁵個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，每孔加入相同質(zhì)量的營養(yǎng)態(tài)酵母或者酵母孢子，每組設(shè)置5個(gè)平行，1300r/min離心3min，使酵母落到細(xì)胞表面，后續(xù)培養(yǎng)30min，PBS洗3次，胰酶消化收集細(xì)胞于離心管，4％多聚甲醛同定10min，PBS洗3次。顯微鏡鏡檢并統(tǒng)計(jì)每100個(gè)巨噬細(xì)胞吞噬營養(yǎng)態(tài)酵母或孢子的個(gè)數(shù)。

用培養(yǎng)基將母液濃度為10mmol/L的Svk抑制劑白皮杉醇稀釋為25μmol/L或50μmol/L的工作濃度；用培養(yǎng)基將母液質(zhì)量濃度為lmg/mL的P13K抑制劑渥曼青霉素稀釋為100ng/mL或200ng/mL。進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)時(shí)，細(xì)胞接種于12孔板培養(yǎng)24h，更換為含有白皮杉醇或渥曼青霉素的培養(yǎng)基并于37℃孵育30min，加入1mg營養(yǎng)態(tài)酵母或lmg酵母孢子或200μg葡聚糖微球，離心并后續(xù)培養(yǎng)30min，統(tǒng)計(jì)相對吞噬效率。

1.8 無血清吞噬實(shí)驗(yàn)

營養(yǎng)態(tài)酵母或孢子與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)前，更換不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基或含有10％血清的培養(yǎng)基處理2h，隨后更換為處理組對應(yīng)的培養(yǎng)基并分別加入lmg的營養(yǎng)態(tài)酵母或酵母孢子，l300r/min離心2min后共培養(yǎng)30min，統(tǒng)計(jì)吞噬效率。
1.9高鹽以及蛋白酶處理對孢子吞噬效率的影響

野生型酵母孢子經(jīng)高鹽(0.6mol/LNaCl或1mol/LPBS)洗滌后，去離子水洗3次，離心稱質(zhì)量。蛋白酶處理野生型酵母孢子時(shí)，取野生型酵母孢子100mg，按照以下反應(yīng)進(jìn)行：50mmol/LTris-HCl(pH7.5)，5mmol/LCaCl₂，加入200μL蛋白酶K(600U/mL)，于37℃處理1h。之后用0.5％吐溫-20洗滌3次，去離子水洗滌3次，超聲30s，制備成100mg/mL的孢子懸液。比較處理組與未處理組吞噬效率。

相關(guān)鏈接：腺嘌呤，蛋白胨，蛋白酶K，胎牛血清

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