2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組β-葡聚糖水解酶的影響

2.3.1 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)Gly5m的影響

由2.2.1可知，重組蕃E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-gly5m在25℃誘導(dǎo)時(shí)酶活最高，故將重組菌在25℃分別誘導(dǎo)4、6、8、10h。離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖4（a）。重組菌在25℃誘導(dǎo)4h后，重組β-葡聚糖水解酶Gly5m總酶活達(dá)到最高，為1086U/mL，且此時(shí)胞外酶活也達(dá)到最高，為888U/mL。此外，重組菌在誘導(dǎo)時(shí)間超過4h后，總酶活開始下降，說明Glv5m不穩(wěn)定，開始降解。

2.3.2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BT3312的影響

由2.2.2可知，重組菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a（+）-bt3312在25℃誘導(dǎo)時(shí)酶活最高，故將重組菌在25℃分別誘導(dǎo)4、6、8、10h。離心得到胞外粗酶液，菌體超聲破碎后得到胞內(nèi)粗酶液，結(jié)果見圖4(b)。重組菌在30℃誘導(dǎo)8h后，總酶活達(dá)到最高，為2355U/mL,且此時(shí)胞內(nèi)、胞外酶活均達(dá)到最高,分別為917、1438U/mL。此外，重組菌在誘導(dǎo)時(shí)間超過8h后，酶活開始下降，說明BT3312也不穩(wěn)定。

2.4 重組β-葡聚糖水解酶的水解產(chǎn)物HPLC分析

以未經(jīng)重組β-葡聚糖水解酶水解的酵母葡聚糖為對(duì)照，對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組水解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見圖5。兩種重組酶都有水解酵母葡聚糖的能力，且兩種重組酶可以同時(shí)添加共同發(fā)揮作用。比較3種水解方式所得產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，經(jīng)BT3312水解后，所得產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量最大，推測(cè)原因可能是BT3312專一性水解β-1，6-糖苷鍵，而在酵母β-葡聚糖中，β-1，6-葡聚糖少，占10％～15％，因此通過BT3312水解后，所得產(chǎn)物中大部分的β-葡聚糖沒有水解，故相對(duì)分子質(zhì)量大。反之，Glv5m主要水解β-l，3-糖苷鍵，在酵母β-葡聚糖中，β-1，3-葡聚糖多，故經(jīng)Glv5m水解后，所得產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量更小。此外，當(dāng)BT3312和Glv5m共同水解時(shí)，水解最徹底，剩余的底物最少，推測(cè)原因是酵母β-葡聚糖中同時(shí)含有β-l，3-糖苷鍵和β-1，6-糖苷鍵，而β-l，6-糖苷鍵的存在可能會(huì)影響β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m發(fā)揮作用，故當(dāng)β-l，6-葡聚糖水解酶BT3312水解掉β-1，6-糖苷鍵后，Gly5m才能更好地發(fā)揮水解作用，使水解更加徹底。

2.5 重組β-葡聚糖水解酶水解產(chǎn)物的溶解率

酵母β-葡聚糖經(jīng)過Gly5m和BT3312單獨(dú)或共同水解后，溶解率均有增加，結(jié)果見圖6。添加相同酶量水解時(shí)，同時(shí)添加Glv5m和BT3312，水解產(chǎn)物溶解率增加量最多，從12％增加到50％，水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為12.5g/L。當(dāng)Gly5m和BT3312共同水解時(shí)，酵母葡聚糖水解最徹底，前后結(jié)果一致。當(dāng)只用Glv5m水解時(shí)，酵母葡聚糖溶解率提高了2.6倍，水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為11g/L；當(dāng)只用BT3312水解時(shí)，酵母葡聚糖溶解率提高了2.4倍。水溶性酵母葡聚糖質(zhì)量濃度為10.25g/L。

3 結(jié)語(yǔ)

酵母β-葡聚糖廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健食品和化妝品行業(yè)中，但因?yàn)槠渌蝗苄?，限制了它的?yīng)用。作者在E.coli中表達(dá)了兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶，兩種酶不僅都有水解酵母β-葡聚糖的能力，而且可以同時(shí)發(fā)揮作用。通過兩種不同的酵母β-葡聚糖水解酶的水解作用，使得酵母β-葡聚糖溶解性增加，且結(jié)構(gòu)和活性不被破壞。但是，兩種水解酶在E.coli中表達(dá)量低,SDS-PAGE檢測(cè)分析中沒有明顯條帶，為進(jìn)一步提高表達(dá)量和酶活，可通過優(yōu)化培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、構(gòu)建不同啟動(dòng)子的表達(dá)系統(tǒng)等進(jìn)行嘗試表達(dá)。此外，作者對(duì)兩種酵母β-葡聚糖水解酶共同水解酵母葡聚糖以提高其水溶性只進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步提高水解效率，可以優(yōu)化水解條件、添加的酶活濃度以及兩種水解酶的比例。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國(guó)食品學(xué)報(bào)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：葡聚糖，酵母，大腸桿菌