高效液相色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)瀉白散及其3種單味藥內(nèi)在質(zhì)量（二）

發(fā)布時(shí)間：2021-11-14 19:42 編輯者：特邀作者周世紅

1.3 溶液制備

1.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取桑辛素、甘草酸、異甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草苷、綠原酸、甘草酸銨、東莨菪內(nèi)酯、大黃素對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為30、82、53、65、60、20、95、100、77、85、80、165、38μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液

按照《小兒藥證直訣》中瀉白散配比，取適量炒桑白皮、地骨皮、炙甘草，粉碎，過孔徑為（250±9.9）μm（65目）篩，混合均勻，制成試驗(yàn)用瀉白散粉末。精密稱取1.00g瀉白散粉末，加水至30mL，回流提取1h，放冷，補(bǔ)重，以3000r/min離心5min，過濾上清液，取續(xù)濾液10mL，按照體積比為1:1加入甲醇，混勻，靜置過夜，過濾上清液，濾液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，得瀉白散供試品溶液，備用。同法分別制備不同批次的瀉白散、炒桑白皮、地骨皮、炙甘草供試品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

采用高效液相色譜法，按1.2色譜條件測(cè)定瀉白散及其3種單味藥飲片樣品溶液，得到各批瀉白散、單味藥高效液相色譜指紋圖譜，計(jì)算各批瀉白散樣品之間、單味藥樣品之間、對(duì)照品與瀉白散樣品之間指紋圖譜的相似度，對(duì)瀉白散中的共有色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水溶液條件下色譜峰分離度較好，基線穩(wěn)定，故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行優(yōu)化梯度洗脫條件；分別比較60、100、120、150min的檢測(cè)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)120、150min均可檢測(cè)出瀉白散中所有的色譜峰，為節(jié)省時(shí)間，選擇檢測(cè)時(shí)間為120min；采用DAD-UV檢測(cè)器對(duì)200～400nm檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在254nm波長(zhǎng)下，色譜峰最多，瀉白散信息量最大，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。

2.2 料液比的優(yōu)化

《小兒藥證直訣》記載瀉白散制法及用法“上銼散，入粳米一撮，水二小盞，煎七分，食前服”，依據(jù)《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015年版）確定炒桑白皮工藝為取桑白皮飲片，照清炒法炒至表面微黃，微具焦斑時(shí)，取出攤涼。參考王彥帥等確定的經(jīng)典名方瀉白散物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝：取炒桑白皮3.93g，焙地骨皮3.93g，炙甘草0.39g，粳米1.50g，加水360mL煎煮，料液比約為1:37。遵循古代經(jīng)方制法、煎煮原則，分別將炒桑白皮、地骨皮、炙甘草粉碎，過孔徑為（250±9.9）μm篩，進(jìn)行加熱回流提取，最終確定料液比為1:30，較為接近古代煎煮工藝。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取桑皮苷A對(duì)照品溶液，在1.2色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取瀉白散組方X10樣品，按1.3.2制備樣品溶液，在1.2色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～1.02%，其中各主要色譜峰保留時(shí)間無明顯變化，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%～1.21%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取瀉白散組方X10樣品，按1.3.2制備樣品溶液6份，在1.2色譜條件下各進(jìn)1次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～2.85%，其中各主要色譜峰的保留時(shí)間無明顯變化，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%～1.56%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立

2.4.1 炒桑白皮指紋圖譜測(cè)定

13批全國(guó)不同飲片企業(yè)市售桑白皮炒制品（S1～S13）按照1.3.2制備供試品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版），HPLC指紋圖譜匹配結(jié)果見圖1。由圖1可知，13個(gè)批次之間的相似度為0.024～0.975，差別非常大，炒桑白皮樣品S8中，各成分的含量非常低，雖然外觀性狀符合炒桑白皮正品特征，但內(nèi)在質(zhì)量非常差，推測(cè)該樣品可能存放時(shí)間太久所致。除S8炒桑白皮樣品外，其它12批炒桑白皮僅有7個(gè)共有峰。

2.4.2 地骨皮指紋圖譜

將13批全國(guó)不同飲片企業(yè)市售地骨皮（D1～D13）按照1.3.2制備供試品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A版），HPLC指紋圖譜匹配結(jié)果見圖2。由圖2可知，13個(gè)批次之間的相似度為0.061～0.983，差別非常大，地骨皮樣品D11、D12、D13與其它樣品的相似度非常低，D12、D13色譜峰數(shù)量及分布與其它地骨皮樣品差別較大，雖然外觀性狀均符合地骨皮正品特征，但內(nèi)在質(zhì)量差異較大。13批地骨皮僅有4個(gè)共有峰。