2 結(jié)果與討論

2.1 COS的酶法制備

考察酶解時(shí)問、加酶量對(duì)殼聚糖酶酶解的影響。如圖1所示，還原糖生成量隨酶解時(shí)問延長(zhǎng)而上升。酶解4h內(nèi)，還原糖含量快速增加，4h之后趨于平穩(wěn)，最佳酶解時(shí)問選定4h。南圖2可知，酶解過程中，還原糖生成量隨著加酶量的升高而逐漸增大。在加酶量為120U/g時(shí)，還原糖生成量近最大值后穩(wěn)定。繼續(xù)增加酶量未能使還原糖質(zhì)量濃度顯著增加。最優(yōu)加酶量選擇為120U/g。

對(duì)酶解液逐步采用乙醇沉淀、超濾、納濾進(jìn)行分級(jí)分離，工藝流程如圖3，最終得到COS產(chǎn)物，得率約41％。

2.2 COS組成分析

采用LC-MS法分析COS產(chǎn)物組成。液相色譜圖中對(duì)應(yīng)3個(gè)保留時(shí)問有吸收峰(見圖4(a))，分別是5.21、6.90、8.36min。分別對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，在ESI⁺模式下，質(zhì)荷比m/z341.1、363.1(見圖4(b))對(duì)應(yīng)[殼二糖+H]⁺、[殼二糖+Nal⁺的分子離子峰，502.2、524.2(見圖4(c))對(duì)應(yīng)[殼三糖+H]⁺、[殼三糖+Nal⁺的分子離子峰，663.3、685.3(見圖4(d))對(duì)應(yīng)[殼四糖+Hl⁺、[殼四糖+Na]⁺的分子離子峰。依此判斷所得COS產(chǎn)物的主要組分為殼二糖、殼三糖和殼四糖。進(jìn)一步通過峰面積積分計(jì)算可知.所得COS組分中殼二糖、殼三糖和殼四糖相對(duì)含量的比例約為3:5:2。

通過自行構(gòu)建的殼聚糖酶酶解，以及多級(jí)分級(jí)處理工藝獲得了低相對(duì)分子質(zhì)量的COS，為后續(xù)抗腫瘤活性的分析提供了更為明確和簡(jiǎn)單的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 COS抗腫瘤作用評(píng)價(jià)

2.3.1 COS對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的抑制活性

研究COS對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和人胰腺癌細(xì)胞PATU-899生長(zhǎng)的影響(見圖5)。在給藥質(zhì)量濃度0～1000μg/mL情況下，未觀察到3株腫瘤細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，可以認(rèn)為低質(zhì)量濃度的COS對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)影響甚微。

類似的結(jié)果在前期A549和HCT-116細(xì)胞的研究中也有報(bào)道。4種來源不同的COS作用時(shí)，高質(zhì)量濃度(1.25～20mg/mL)明顯抑制細(xì)胞增長(zhǎng)，而低質(zhì)量濃度(0.078125～1.25mg/mL)呈現(xiàn)負(fù)抑制作用。

其中相對(duì)分子質(zhì)量在1500～2000的COS樣品即使在高質(zhì)量濃度(1.25～20mg/mL)下對(duì)A549細(xì)胞依然無細(xì)胞毒性。綜觀已報(bào)道的研究結(jié)果，多數(shù)報(bào)道可顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的研究巾使用的COS質(zhì)量濃度較高，如相對(duì)分子質(zhì)量1000～3000的COS在質(zhì)量濃度5.0mg/mL時(shí)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抑制效果最佳；2～5mg/mL的COS對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率有劑量依賴關(guān)系。COS的腫瘤抑制活性因自身相對(duì)分子質(zhì)量、給藥質(zhì)量濃度以及評(píng)價(jià)用細(xì)胞株的不同而各異，因此有必要進(jìn)行更為細(xì)致地考察和分析。

2.3.2 COS聯(lián)合DOX對(duì)不同癌細(xì)胞的抑制活性

近期研究發(fā)現(xiàn)，在多株骨肉瘤細(xì)胞巾，甘露糖與DOX或順鉑聯(lián)，用可通過下調(diào)Bcl-2家族的Mcl-1和Bcl-X_L蛋白質(zhì)表達(dá)水平而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)在凋亡途徑，提高抗腫瘤作用。DOX是治療乳腺癌、肝癌等實(shí)體瘤的一種常用化療藥物。DOX的非靶向性可對(duì)正常細(xì)胞造成損傷。因此，新的方案建議可與其他藥物或天然產(chǎn)物聯(lián)用降低用藥量以減少其副作用。受此啟示，將COS與DOX復(fù)合給藥以評(píng)價(jià)其效果。如圖6所示，相較于DOX組50％的細(xì)胞生存率，COS僅在人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231上表現(xiàn)出增強(qiáng)DOX抑制作用的效果，且在較低質(zhì)量濃度下細(xì)胞生存率可下降20％～30％。由此選定MDA-MB-231細(xì)胞為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的模型，進(jìn)一步探討復(fù)合給藥的效果和機(jī)制。
 

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