干酪乳桿菌發(fā)酵及熱加工方式對(duì)小麥蛋白抗原性的影響（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-09-08 15:18 編輯者：特邀作者周世紅

小麥過敏、乳糜瀉、非乳糜瀉小麥敏感(NCGS)等“小麥相關(guān)疾病”在世界各地的發(fā)病率在不斷上升。對(duì)于這些疾病患者而言。避免攝入小麥致敏蛋白是唯一且有效的方法圈。除探究過敏機(jī)制、尋找治療的突破點(diǎn)外，研發(fā)低致敏性的小麥?zhǔn)澄锍蔀楫?dāng)前亟待解決的問題。乳酸菌在發(fā)酵過程中通過自身的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)降解相關(guān)蛋白質(zhì)及多肽，并通過產(chǎn)酸改變發(fā)酵面團(tuán)的pH值以激活面粉的內(nèi)源性蛋白酶.進(jìn)一步加強(qiáng)蛋白質(zhì)的降解。在蛋白質(zhì)降解為多肽及氨基酸時(shí)，既改變了面團(tuán)風(fēng)味，也改變了致敏蛋白的含量。此外，乳酸菌代謝產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)可以延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，產(chǎn)生的胞外多糖可以改善面團(tuán)的品質(zhì)。鑒于此，乳酸菌發(fā)酵作為一種很有前景的發(fā)酵方式，值得進(jìn)一步的探究。乳酸菌種類繁多，目前對(duì)于其降低小麥蛋白抗原性的研究多集中于植物乳桿菌發(fā)酵方面。干酪乳桿菌被證實(shí)具有細(xì)胞被膜蛋白酶，而這種酶在降解蛋白質(zhì)的過程中起到很重要的作用。此外，大量研究表明加工方式影響食物蛋白的抗原性，目前用于降低食物蛋白抗原性的加工方法主要有熱加工(蒸煮、烘烤等)和非熱加工(發(fā)酵、酶解、超聲等)。蒸煮等熱加工方式會(huì)改變食物蛋白的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而改變抗原的構(gòu)象表位。而抗原蛋白線性表位的破壞主要發(fā)生在發(fā)酵和酶解過程中。Rao等研究發(fā)現(xiàn)低溫烘烤和水煮能夠產(chǎn)生較低致敏性的花生。Rui等利用植物乳桿菌發(fā)酵降低了大豆分離蛋白的抗原性。利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶連續(xù)酶解降低了小麥中致敏谷蛋白含量。本研究利用分離自老面中的1株干酪乳桿菌發(fā)酵面團(tuán)，研究其對(duì)小麥致敏蛋白含量及抗原性的影響，研究加工條件與抗原性之間的關(guān)系，為開發(fā)低致敏性小麥制品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革蘭氏染色試劑盒、細(xì)菌組DNA提取試劑盒、乳酸桿菌選擇性瓊脂、Bradfbrd蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE分離/濃縮膠緩沖液、預(yù)染蛋白Maker、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、AP-羊抗兔二抗、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒。北京索萊寶科技有限公司：EL-TMB顯色試劑盒，上海生工生物：試驗(yàn)所用試劑均為分析純級(jí)，兔過敏血清由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器

PCR熱循環(huán)儀，杭州晶格科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；Mul-tiskanFC酶標(biāo)儀，上海賽默飛公司；mini-proteanⅡ凝膠儀，美國(guó)伯樂公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干酪乳桿菌的分離鑒定

稱取酸面團(tuán)樣品5g于無菌均質(zhì)袋中，加入45mL滅菌后的蛋白胨水(1％蛋白胨，0.43％NaCl，0.72％Na₂HP0₄，0.36％KH₂PH0₄，pH7.0)，混勻后梯度稀釋，取10^-5～10^-7稀釋梯度，涂布于乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。隨機(jī)挑取菌落進(jìn)行過氧化氫酶和革蘭氏染色試驗(yàn)。取過氧化氫酶陰性、革蘭氏陽性且鏡檢為桿狀的菌株進(jìn)行進(jìn)一步分子鑒定。

采用細(xì)菌組DNA提取試劑盒提取所分離菌株的DNA，利用細(xì)菌通用引物27F(5’-AGCG-GATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTrGTACGA-3’)和1492R(5’-GCAGAGTTCTCGGAGT.CACGAAGAGTlTI’GATCCTGGCTCAG-3’)通過PCR反應(yīng)對(duì)16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min：94℃變性30s。55℃退火30s，72℃延伸5min，35個(gè)循環(huán)：72℃充分延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送于北京生工生物工程有限公司測(cè)序。所得序列與NCBI文庫比對(duì)后，用MegaX構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.3.2 菌株生長(zhǎng)曲線和菌落數(shù)與0D值對(duì)應(yīng)關(guān)系的測(cè)定

取一支凍存菌種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃下活化24h。取O.5mL活化菌液于6個(gè)分別裝有30mLMRS肉湯的三角瓶中。37℃培養(yǎng)0，4，8，12，16，20h，在波長(zhǎng)600nm處測(cè)量各時(shí)段菌液吸光度值，繪制生長(zhǎng)曲線。

取活化菌液用MRS肉湯稀釋2，2.5，3，4，5，6倍，測(cè)定0D600nm值，并梯度稀釋，傾注于MRS瓊脂中，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)算活菌數(shù)。

1.3.3 酸面團(tuán)的制備

取指數(shù)生長(zhǎng)期菌液，6000×g離心10min，生理鹽水洗滌2次，雙蒸水重懸浮至50mL，調(diào)節(jié)OD‰值為0.8。100g面粉與50mL菌懸液投入和面機(jī)。和面15min，面團(tuán)內(nèi)菌體數(shù)量約為108CFU/g。發(fā)酵溫度30℃，相對(duì)濕度80％。發(fā)酵24h，定時(shí)取樣。

1.3.4 發(fā)酵過程中pH值、可滴定酸度(TTA)和面團(tuán)蛋白含量的測(cè)

每隔2h取樣，于無菌均質(zhì)袋中10倍稀釋后混合均勻，測(cè)定pH值并用0.1mol/LNa0H滴定至pH值為8.3，記錄所消耗Na0H的體積數(shù)即，TTA值。

將發(fā)酵面團(tuán)樣品凍干后磨粉于-20℃保存。蛋白提取參照Prado等的方法。具體操作如下：向500mg面粉中加入10mL％s-HCl緩沖液(50mm01，L，pH8.8)，于4℃下攪拌1h，20000×g，4℃離心20min，收集上清液(清蛋白和球蛋白)；沉淀用5mL緩沖液洗滌3次，加入10mL75％乙醇，室溫下攪拌1h，離心20min，收集上清液(醇溶蛋白)；采用5mL75％乙醇洗滌沉淀3次，加入10mL50mmol/LTris-HCl(pH8.8，1％SDS，0.5％DTT)，4℃攪拌2h，離心20min，收集上清液(谷蛋白)。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.5 SDS-PAGE電泳及免疫印跡分析

參照Rao等的方法，具體操作如下：制備12％的分離膠和5％的濃縮膠，樣品溶液稀釋為相同濃度后與5x上樣緩沖液混合并沸水加熱5min，進(jìn)樣后進(jìn)行垂直電泳(濃縮膠電壓80V，分離膠電壓110V)，電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)R250染色，脫色后于凝膠成像系統(tǒng)拍照。

未染色的電泳膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(300mA冰浴下轉(zhuǎn)膜90min)，麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜成功。加入5％脫脂奶粉，搖床上搖動(dòng)封閉2h；加入稀釋的-抗(抗小麥蛋白兔血清)，4℃下孵育過夜；TBST緩沖液(0.02mol/LTBS，0.05％Tween-20，pH7.6)洗膜后，加入稀釋的AP-羊抗兔二抗，室溫下孵育90min；洗膜后。利用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色。

1.3.6 不同發(fā)酵方式及熱加工方法制作饅頭

向100g面粉(乳酸菌菌落數(shù)108～109CFU/g)中加入50mL菌懸液和0.35g安琪酵母調(diào)制面團(tuán)后分別發(fā)酵。冷藏發(fā)酵條件為：4℃發(fā)酵3d后于37℃，80％相對(duì)濕度發(fā)酵60min：一次發(fā)酵條件為：37℃，80％相對(duì)濕度發(fā)酵60min；二次發(fā)酵條件為：中種面團(tuán)(60g面粉，0.35g酵母，30mL菌懸液)于37℃發(fā)酵4h后加入40g面粉和20mL水繼續(xù)發(fā)酵1h。發(fā)酵好的3種面團(tuán)用于烤制(180℃，20min)和蒸制(沸水蒸制20min)。取樣凍干，磨粉備用。

1.3.7 蛋白含量及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)

總蛋白提取參照Akagawa等的方法，具體操作如下：25mg面粉加入1mL蛋白提取液[40mmol/LTris，8mol/L尿素，4％3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽(cHAPs)，冰浴下超聲提取30s，6次；4℃下16000×g離心20min，收集上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)評(píng)價(jià)樣品抗原性。使用50mmol/L，pH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋蛋白至5μg/mL，按100μL孔加入酶標(biāo)板，4℃靜置過夜；用TBST洗板4次，按150μL/孔加入1％BSA封閉液，37℃溫育2h；TBST洗板后按100μL/孔加入使用1％BSA稀釋的抗小麥蛋白兔血清稀釋液(1:10000)，37℃溫育2h，洗板；按100μL/孔加入500倍稀釋的羊抗兔HRP-IgG，37℃溫育1h，洗板；使用TMB顯色試劑盒顯色，于波長(zhǎng)450nm處測(cè)0D值。