4、方法學(xué)驗(yàn)證（線）性試驗(yàn)

精密移取低濃度混合對(duì)照品溶液20、50、100μl和0.5、1、2ml于10ml具塞刻度試管中，用甲醇稀釋并定容，即得系列混合濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。其中，1的濃度為O.03、0.09、0.17、0.85、1.71、3.14μg／ml；2的濃度為0.01、0.03、0.05、0.25、0.51、1.01μg／ml；3的濃度分別為0.36、0.9l、1.81、9.06、18.10、36.20μg／ml；4的濃度分別為0.03、0.09、0.17、0.86、1.72、3.44μg／ml。將系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液按色譜柱TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A為5mmol／L磷酸二氫鉀溶液，B為乙腈：甲醇(9:1)，梯度洗脫(8min，A75％；8-12min，A75％-40％：12-25min，A40％：25-27min，A40％-75％；27L-35min，A75％)；流速1.0ml／min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300nm；進(jìn)樣量20μl方法檢測(cè)，以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。取對(duì)照品混合溶液進(jìn)一步稀釋進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算LOD及LOQ，結(jié)果如表1所示。

（2）精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密移取低濃度混合對(duì)照品溶液1m1置10ml量瓶中，用甲醇稀釋定容，按色譜柱TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A為5mmol／L磷酸二氫鉀溶液，B為乙腈：甲醇(9:1)，梯度洗脫(旺8min，A75％；8-12min，A75％-40％：12-25min，A40％：25-27min，A40％-75％；27L-35min，A75％)；流速1.0ml／min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300nm；進(jìn)樣量20μl下方法測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示1、2、3、4峰面積的RSD（n=6)分別為0.48％、0.49％、0.59％、0.37％，儀器精密度良好。

精密移取低濃度混合對(duì)照品溶液20、100、1000μl置10ml量瓶?jī)?nèi)，用甲醇稀釋并定容，即得低、中、高濃度穩(wěn)定性工作液，分別于0、4、8、16、24h和2、3、4、5d時(shí)，按色譜柱TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A為5mmol／L磷酸二氫鉀溶液，B為乙腈：甲醇(9:1)，梯度洗脫(旺8min，A75％；8-12min，A75％-40％：12-25min，A40％：25-27min，A40％-75％；27L-35min，A75％)；流速1.0ml／min；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300nm；進(jìn)樣量20μl方法測(cè)定。按1、2、3、4的峰面積計(jì)算RSD。結(jié)果顯示低濃度穩(wěn)定性工作液24h內(nèi)RSD(n=3)分別為3.97％、3.45％、0.97％、0.14％；中濃度穩(wěn)定性工作液24h內(nèi)RSD(n=3)分別為0.41％、0.59％、0.26％、0.27％；高濃度穩(wěn)定性工作液24h內(nèi)RSD(n=3)分別為0.56％、2.02％、0.66％、0.54％；低濃度穩(wěn)定性工作液5d內(nèi)RSD(n=3)分別為1.24％、0.93％、1.35％、0.97％；中濃度穩(wěn)定性工作液5d內(nèi)RSD(n=3)分別為0.52％、1.13％、0.64％、0.56％：高濃度穩(wěn)定性工作液5d內(nèi)RSD(n=3)分別為1.15、1.30％、1.04％、0.90％。供試液低、中、高濃度對(duì)照液日內(nèi)、日間均穩(wěn)定性良好。

（3）回收率試驗(yàn)

受控提取試驗(yàn)回收率：取膠塞約1g，剪成0.3cm×0.3cm小塊，置于中硼硅玻璃瓶?jī)?nèi)(規(guī)格100m1)，精密加入高濃度混合對(duì)照品溶液20、40、60μl，搖勻，制得低、中、高濃度材料加標(biāo)提取溶液，受控提取供試液的制備：取橡膠材料約1.0g，剪碎，置于中硼硅玻璃瓶?jī)?nèi)(規(guī)格100m1)，加入二氯甲烷40ml后密封，(16士5)℃超聲波水浴提取30min，取出放冷，過(guò)濾，采用適量二氯甲烷蕩洗容器，濾液及洗液置于100ml量瓶中，同法提取2次，合并濾液并定容，得材料提取液。受控提取供試液的前處理：取上述材料提取液2ml于10ml具塞刻度試管中，用甲醇稀釋至4ml，即得受控提取供試液，同法制備空白溶液。

模擬提取供試液的制備：(1)膠塞：以模擬溶劑I～Ⅳ為提取溶劑，分別按每西林瓶10ml灌裝，加待測(cè)膠塞，壓鋁蓋，倒立放置，121℃高壓滅菌lh，放冷至室溫，將各提取液分別合并至燒杯內(nèi)，得膠塞供試液I～Ⅳ，同法制備空白。(2)EPDM卡箍密封圈：以模擬溶劑I～Ⅳ為提取溶劑，將EPDM卡箍密封圈裝入管道中，灌裝，密封，60℃高溫烘箱放置24h，取出放冷，得EPDM卡箍密封圈供試液I～Ⅳ，同法制備空白。模擬提取供試液的前處理：取上述模擬提取供試液I～Ⅲ各25ml，分別加入6mol／L鹽酸溶液20、40、80μl，調(diào)至pH1.8～2-3，混勻。取甲醇、水各5ml依次活化固相萃取小柱，提取液以流速1.5～2ml／min通過(guò)固相萃取小柱，取水20m1淋洗，甲醇4ml洗脫，收集洗脫液于5ml具塞刻度試管，用甲醇定容，即得。取供試液Ⅳ10ml，加入6mol／L鹽酸溶液100μl，調(diào)至pH1.2～1.5，加入氯化鈉4g吸水，加入甲基叔丁基醚2ml，渦旋3min，取上清液于10ml具塞刻度試管中，萃取3次，合并上清液，40℃水浴，氮吹至0.5ml，甲醇定容至2m1，即得。對(duì)照品溶液：分別精密稱取1、2、3、4對(duì)照品25.1、25.3、266.4、25.3mg各置于10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，即得對(duì)照品溶液。高濃度混合對(duì)照品溶液：分別移取對(duì)照品溶液0.6、1.0、0.6、0.6ml置10ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻后即得高濃度混合對(duì)照品溶液。低濃度混合對(duì)照品溶液：分別移取對(duì)照品溶液1.7、0.5、1.7、1.7ml置100ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻后即得低濃度混合對(duì)照品溶液。方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算目標(biāo)物在二氯甲烷中的平均回收率(以=3)，各目標(biāo)物在二氯甲烷中的回收率良好，符合方法學(xué)驗(yàn)證要求。
 

模擬提取試驗(yàn)回收率：(1)取模擬溶劑Ⅰ～Ⅲ25m1，分別加入低濃度混合對(duì)照品溶液20、50、100μ1，搖勻，制得低、中、高濃度加標(biāo)溶液。受控提取供試液的制備：取橡膠材料約1.0g，剪碎，置于中硼硅玻璃瓶?jī)?nèi)(規(guī)格100m1)，加入二氯甲烷40ml后密封，(16士5)℃超聲波水浴提取30min，取出放冷，過(guò)濾，采用適量二氯甲烷蕩洗容器，濾液及洗液置于100ml量瓶中，同法提取2次，合并濾液并定容，得材料提取液。

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