乳酸菌飲料是指以乳或乳制品為原料，經(jīng)化料、水合、殺菌，接種發(fā)酵劑所得發(fā)酵基料，按照一定比例混入水、食品添加劑（甜味劑、酸味劑、穩(wěn)定劑）調(diào)配后制得的飲料。乳酸菌飲料作為健康飲品以其獨特的風味和優(yōu)質(zhì)的保健功效贏得廣大消費者的追捧。相關(guān)資料顯示，近5年，世界乳酸菌飲料市場份額不斷增加，其市場規(guī)模超過500億美元。益生菌是一類能夠改善宿主腸道菌群平衡并有效增強食用者身體健康水平的活性有益微生物，其具有改善便秘、緩解腹瀉、抗腫瘤、保護口腔健康等重要生理功效；Buriti等應(yīng)用L.rhamnosusLR-32和B.lactisBB12復(fù)配發(fā)酵山羊乳清飲料，并添加適量的膳食纖維，所得產(chǎn)品在貯藏期（4℃、24d）內(nèi)活菌數(shù)維持在1×108CFU/g以上，膳食纖維的添加能夠改善山羊乳清飲料的口感、風味并增進其功能特性，活性乳酸菌飲料將菌株的益生特性與乳制品的健康功效完美結(jié)合，同時乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種維生素、有機酸、抗菌肽等生物活性物質(zhì)能夠有效提高產(chǎn)品的功能特性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者主要針對基礎(chǔ)發(fā)酵劑在發(fā)酵乳中的產(chǎn)香機理進行研究，而對于復(fù)合益生菌在發(fā)酵乳制品中的揮發(fā)性代謝物及產(chǎn)香機制研究較少。Karacali等研究開菲爾粒對雙蛋白乳飲料（按牛奶與豆奶質(zhì)量比17:3混合）揮發(fā)性風味物質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用開菲爾粒發(fā)酵能夠促進雙蛋白飲料中雙乙酰、乙偶姻等具有脂肪香、奶油氣息等揮發(fā)性風味物質(zhì)的產(chǎn)生，降低其（E）-2-己烯醛、1-己醇等致豆腥味揮發(fā)性風味物質(zhì)的含量。固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（SPME-GCMS）具有操作簡單、靈敏度高、分析范圍廣等特點，目前，該技術(shù)主要用于乳制品、肉制品以及發(fā)酵果蔬中風味物質(zhì)的檢測。

本研究以含有8株菌株的復(fù)合益生菌發(fā)酵3種基料的乳酸菌飲料為對象，應(yīng)用SPME-GC-MS技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析乳酸菌飲料發(fā)酵及貯藏期內(nèi)揮發(fā)性代謝物的變化，通過OAＶ值確定乳酸菌飲料中的關(guān)鍵揮發(fā)性風味物質(zhì)，對3種基料的乳酸菌飲料整體風味進行比較預(yù)測，為復(fù)合益生菌的商業(yè)化應(yīng)用及活性乳酸菌飲料的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料與儀器

試驗菌株本試驗所用益生菌（見表1）直投式發(fā)酵劑由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點實驗室提供。

1.1.2儀器與試劑

SRH60-70高壓均質(zhì)機，上海申鹿均質(zhì)機有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent7890BGCsystem-5977AMSD），賽默飛世爾科技有限公司；色譜柱（HP-5毛細管柱30m×0.25mm，0.25μm），賽默飛世爾科技有限公司；手動固相微萃取（SPME）進樣手柄（USA，SUP-ELCO），賽默飛世爾科技有限公司；固定搭載裝置及50/30μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭，賽默飛世爾科技有限公司；陶瓷加熱磁力攪拌器（Corning），美國Agilent公司；脫脂乳粉（蛋白質(zhì)含量33%），新西蘭NZMP；濃縮乳清蛋白粉（蛋白質(zhì)含量80%），美國HILMAR公司；大豆分離蛋白粉（蛋白質(zhì)含量95%，富吉普樂200），吉林不二蛋白有限公司；C3-C9正構(gòu)烷烴混標（AccuStandard，USA）、C10-C25正構(gòu)烷烴混標（AccuStandard，USA）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、1，2-二氯苯（色譜純）等均購于美國Sigma公司。

1.2試驗方法

1.2.1乳酸菌飲料的制備

分別將脫脂乳粉（12.1%）、乳清蛋白粉（5.0%）、大豆分離蛋白粉（4.2%）與葡萄糖（2%）混合溶解于預(yù)熱至55℃的蒸餾水中，水合30min，85℃殺菌15min，冷卻至37℃，將復(fù)合菌株按照總接種量5×106CFU/g接入3種不同發(fā)酵基料中，具體接種量如表2所示，3種發(fā)酵基料蛋白質(zhì)含量均為4%，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵，待到達發(fā)酵終點得發(fā)酵基料（復(fù)合益生菌在3種基料中生長至穩(wěn)定期）；將發(fā)酵基料與預(yù)先溶解并冷卻的穩(wěn)定劑、甜味劑混合，調(diào)配，20MPa均質(zhì)，所得樣品（蛋白質(zhì)含量均為1%）即為發(fā)酵基料不同的3種乳酸菌飲料。

1.2.2發(fā)酵前及貯藏期內(nèi)揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

采用50/30μmDＶB/CAR/PDMS萃取頭，對發(fā)酵前及發(fā)酵結(jié)束后貯藏0，14，28d的脫脂乳飲料、豆乳飲料、乳清飲料進行富集，每組3個平行，隨后應(yīng)用GC-MS技術(shù)對其揮發(fā)性風味物質(zhì)進行檢測分析。

1.2.3揮發(fā)性風味物質(zhì)的萃取條件與測定條件

1）色譜條件載氣為He，流速1.0mL/min；不分流進樣，進樣口溫度250℃。程序升溫方式，起始溫度為35℃，保持5min后以5℃/min的速率上升至140℃，保持2min，再以10℃/min的速率上升至250℃，保持3min。

2）質(zhì)譜條件全掃描模式；EI離子源；電子能量70eＶ；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z35～500；無溶劑延遲。

3）SPME萃取條件50℃平衡60min。

4）解吸附條件250℃條件下解吸附3min。

1.2.4定性、定量分析

定性方法：利用隨機攜帶Masshunter工作站NISＴ11標準庫進行自動比對，挑選匹配率≥85%的物質(zhì)作為鑒定結(jié)果，同時依據(jù)Ｖandendool等的方法測定保留指數(shù)（retentionindices，RI），根據(jù)文獻報道的RI值對發(fā)酵乳樣品中的揮發(fā)性風味物質(zhì)進行再次鑒定，RI值計算公式如下：

式中：RＴ_（z）、RＴ_（z+1）和RＴ_（x）分別為正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)為Z、Z+1和待測物x的保留時間，且RＴ_（z）＜RＴ_（x）＜RＴ_（z+1）。

定量方法：在5mL發(fā)酵樣品中添加質(zhì)量濃度為0.01μg/L的內(nèi)標物1，2-二氯苯溶液50μL，樣品中各組分風味物質(zhì)的濃度可代入公式（2）計算：

式中：C_i—待測樣品中各風味化合物質(zhì)量濃度，μg/L；Cs—1，2-二氯苯質(zhì)量濃度，μg/L；A_i—樣品中待測物質(zhì)對應(yīng)的色譜峰面積；As—內(nèi)標物色譜峰面積。

1.2.5香氣活度值評價法

在對乳酸菌飲料中揮發(fā)性風味化合物定量的基礎(chǔ)上，以各風味化合物在水中的風味閾值作為參考，計算能表征風味化合物貢獻率的物理量—香氣活度值（odoractivityvalue，OAＶ）。可代入公式（2）計算：

式中：OAV_i—風味化合物i的香氣活度值；

C_i—乳酸菌飲料中揮發(fā)性風味化合物質(zhì)量濃度，μg/L；OT_i—所測風味化合物在水中的氣味閾值。

1.3數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS21.0軟件進行顯著性、主成分分析處理，使用Originlab2017、SIMCA-P14.1作圖。

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相關(guān)鏈接：乳酸菌，2-二氯苯，聚二甲基硅氧烷，丙酮