目的研制冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，作為量值傳遞的標(biāo)準(zhǔn)。方法參照J(rèn)JF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》和JJF 1644—2017《臨床酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制》要求進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性、互換性評價；聯(lián)合6家通過中國合格評定國家認(rèn)可委員會（CNAS）認(rèn)可的校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，評定其均勻性、穩(wěn)定性和定值引入的不確定度，計(jì)算擴(kuò)展不確定度。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性和穩(wěn)定性均良好，互通性評價結(jié)果顯示，4個常規(guī)檢測系統(tǒng)的測量值均位于95%可信區(qū)間內(nèi)。定值結(jié)果：水平1為（106.3±4.3）U/L(k=2)，水平2為（268.1±7.9）U/L(k=2)。結(jié)論研制的冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)示值可靠，均勻性、穩(wěn)定性較好，具有互換性。

血清、尿液α-淀粉酶測量是臨床上最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)之一，在胰腺疾病，特別是急性胰腺炎的診斷、療效觀察中具有重要作用。淀粉酶是急性胰腺炎早期診斷指標(biāo)，為解決臨床檢驗(yàn)血清淀粉酶測量結(jié)果的正確性，實(shí)現(xiàn)測量結(jié)果的可溯源性和臨床檢驗(yàn)結(jié)果可比、互認(rèn)，減少重復(fù)檢查，減輕患者負(fù)擔(dān)，本實(shí)驗(yàn)室制備了2個水平的冰凍人血清α-淀粉酶催化活性濃度候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1材料和方法

1.1儀器與試劑

cobas 8000全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品，U-3310分光光度計(jì)（日本日立公司）。參考方法試劑：N-2-羥基乙基哌嗪-N'-乙基磺酸（批號為017K5410，美國Sigma公司），4,6-亞乙基-4-硝基苯-α-（1->4)-D-麥芽七糖（批號為121214A，北京阿匹斯公司）。有證參考物質(zhì)IRMM/IFCC-456（歐盟參考物質(zhì)和測量研究中心）。

1.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣本制備

選擇外觀清亮，無脂血、黃疸和溶血的樣本。乙型肝炎病毒表面抗原、梅毒螺旋體抗體、丙型肝炎病毒抗體、人類免疫缺陷病毒抗體檢測陰性。經(jīng)2次除菌過濾后，分裝至無菌收集管中，每支1 m L，共300支。制備了2個水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可-70℃冰箱保存。

1.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評價

按照J(rèn)JF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》和JJF 1644—2017《臨床酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制》要求進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性、互換性評價，所有樣本均采用cobas 8000全自動生化分析儀測量。

1.3.1均勻性檢驗(yàn)

取15支樣本，在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行評價。方差分析結(jié)果中的組間方差MSamong>組內(nèi)方差MSwithin時，樣本間均勻性的標(biāo)準(zhǔn)偏差sbb計(jì)算公式為：

式中ubb,rel為α-淀粉酶由于樣本不均勻性引入的不確定度分量。

1.3.2穩(wěn)定性評價

采用同步穩(wěn)定性進(jìn)行評估，結(jié)果采用回歸分析的t檢驗(yàn)進(jìn)行評價，基本模型為：Y=β0+β1X，式中β1、β0為回歸系數(shù)，X為時間，Y為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性值。（1）短期穩(wěn)定性評價。評價運(yùn)輸對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)待定特性值的影響。分別于第1、2、3天從冰箱中取出樣本，放入干冰冷凍包裝箱，與第5天從儲存冰箱中取出的樣本同時進(jìn)行測量。每個水平1個監(jiān)測點(diǎn)抽取2支樣本，4個監(jiān)測點(diǎn)合計(jì)8支樣本。在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。（2）長期穩(wěn)定性評價。評價標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-70℃保存1年的穩(wěn)定性。分別于第0、7、31、90、182天從-70℃冰箱中取出樣本，放入液氮瓶中，與第365天從-70℃冰箱中取出的樣本同時進(jìn)行測量。每個水平1個監(jiān)測點(diǎn)抽取3支樣本，共6個監(jiān)測點(diǎn)，合計(jì)18支樣本，在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。（3）使用時穩(wěn)定性評價。評價標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用時儲存于冰箱（2～8℃）或室溫（20～25℃）的穩(wěn)定性。分別于24、6、4、2 h從-70℃冰箱中取出4支樣本，冰箱或室溫各放置2支，與測量前從-70℃冰箱中取出的樣本同時進(jìn)行測量。每個水平1個監(jiān)測點(diǎn)抽取4支樣本，冰箱或室溫環(huán)境各放置2支，進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗(yàn)，共5個監(jiān)測點(diǎn)，合計(jì)20支樣本。在1個批次內(nèi)完成測量，每支樣本重復(fù)測量3次。（4）穩(wěn)定性引入的不確定度。由穩(wěn)定性引入的不確定度計(jì)算公式為：us=s（β1）×X，式中us為由穩(wěn)定性引入的不確定度，s（β1）為β1的標(biāo)準(zhǔn)偏差，X為給定的保存期限。

1.3.3互換性評價

互換性采用最小二乘法進(jìn)行線性回歸分析。（1）參比檢測系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室參照2006年國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會推薦的α-淀粉酶參考測量程序（37℃）建立一級參考方法。（2）臨床評價檢測系統(tǒng)。系統(tǒng)1：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀及配套試劑（AMY384295）、校準(zhǔn)品（cfas,lot:305596）和測量程序；系統(tǒng)2：美國貝克曼庫爾特公司A U 5 8 0 0全自動生化分析儀及配套試劑（AMY6159）、校準(zhǔn)品（lot:F6662）和測量程序；系統(tǒng)3：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司試劑（AMY142819001）、校準(zhǔn)品（059318006）和測量程序；系統(tǒng)4：瑞士羅氏公司cobas 8000全自動生化分析儀、四川邁克生物股份有限公司試劑（AMY0518061）、校準(zhǔn)品（Lot:366059）和測量程序。（3）樣本。共20份新鮮單供體人血清樣本，濃度范圍覆蓋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度范圍，每個樣本重復(fù)測量2次。

1.4定值

1.4.1定值方法

定值依據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行（同參比檢測系統(tǒng)）。2個水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)每日分別測量3次，連續(xù)測量3 d，共9個測量結(jié)果。

1.4.2定值方式

由6家通過中國合格評定國家認(rèn)可委員會認(rèn)可的參考（校準(zhǔn)）實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值。

1.4.3定值及其引入的不確定度計(jì)算

根據(jù)測定數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布狀態(tài)，組間數(shù)據(jù)是否為等精度進(jìn)行計(jì)算。

1.4.4結(jié)果檢驗(yàn)

采用Shapiro-Wilk進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，采用格拉布斯（Grubbs）法進(jìn)行組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)和各組數(shù)據(jù)平均值顯著性檢驗(yàn)，組間數(shù)據(jù)等精度檢驗(yàn)采用科克倫（Cochran）法。

1.4.5標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uCRM）計(jì)算公式為：

式中ub b為由甁間不均勻性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，ults為由長期（1年）不穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，usts為由短期不穩(wěn)定性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，uchar為由定值引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。擴(kuò)展不確定度（UCRM）按照公式：UCRM=合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度（uCRM）×κ計(jì)算，式中κ為包含因子，此處κ=2（置信水平為95%）。

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