草酸青霉WX-209的安全性評(píng)估

發(fā)布時(shí)間：2023-12-24 19:32 編輯者：陳丹

1 Introduction

在果汁和罐頭生產(chǎn)中，去除果肉表皮包裹的囊衣是一大難題。常用的方法包括酸堿法，但會(huì)產(chǎn)生囊衣碎片殘留物，影響產(chǎn)品的感官和口感，還有物理或機(jī)械剝離的方法，但其不僅耗費(fèi)人力，效率低下，還會(huì)破壞果肉完整性。無法滿足無害環(huán)境和節(jié)約資源的需求，許多物理或化學(xué)處理已逐漸被生物處理所取代。微生物潛力巨大，因其相對(duì)便宜，高效和環(huán)保的特性而引起廣泛關(guān)注。

多種研究已經(jīng)探索了青霉菌與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生有關(guān)，例如P. oxalicum 114-2、P. Arizona、P. echinulatum等。絲狀真菌及其主要分泌物，特別是水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等，可用于食品生產(chǎn)、有機(jī)合成、化妝品和動(dòng)物飼料制造以及各種行業(yè)。青霉菌的酶由于其基因組特性而被用于實(shí)際應(yīng)用，草酸青霉菌屬經(jīng)研究有利于產(chǎn)生果膠酶，果膠裂解酶和果膠酯酶等多種酶，并提高葡萄汁，橙汁和蘋果汁的產(chǎn)量。

然而，酶法脫皮在食品中并沒有得到廣泛應(yīng)用，部分原因是其安全性不能保證或效果不好。在果汁生產(chǎn)中，果皮碎屑或沉淀物的出現(xiàn)會(huì)影響果汁澄清度。一些青霉菌屬會(huì)產(chǎn)生霉菌毒素，其對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)有毒，會(huì)致癌和致突變。有些酶法脫皮需要結(jié)合物理?xiàng)l件才能發(fā)揮更好的效果，如機(jī)械剝離和真空灌注等。因此，找到一種能夠安全有效地達(dá)到更好剝離效果的高產(chǎn)復(fù)合酶是一項(xiàng)重要的任務(wù)。

本文探討了從生物質(zhì)廢棄物中分離出的草酸青霉WX-209的粗酶液安全性以及其降解柑橘囊衣的能力，并通過全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)了其產(chǎn)生酶的基因片段，研究了與纖維素和半纖維素降解相關(guān)的基因。這是為了了解用于食品生產(chǎn)過程中的草酸青霉WX-209的酶生產(chǎn)能力。同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了生物廢棄物的綜合利用。觀察其產(chǎn)生的粗酶液對(duì)柑橘囊衣的降解作用，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估粗酶液的安全性，為果蔬生產(chǎn)工藝中低成本、高效、安全的酶去皮法的實(shí)現(xiàn)提供了依據(jù)。

2 Results and Discussion

2.1 柑橘囊衣降解

草酸青霉WX-209粗酶液能有效地降解柑橘囊衣。柑橘囊衣在處理過程中隨著時(shí)間的推移而溶解和消失，柑橘囊衣的果肉明顯暴露。柑橘囊衣的細(xì)胞壁在初始結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞間隔均勻。10 min后，盡管細(xì)胞保持一定的排列順序，但細(xì)胞壁被破壞，細(xì)胞間物質(zhì)減少并且密度降低。20 min后，邊緣開始溶解，細(xì)胞變形并融合，細(xì)胞間質(zhì)顯著溶解。30 min后，細(xì)胞失去完整性，細(xì)胞內(nèi)容物泄漏出來。40 min后，細(xì)胞分解，纖維變薄并分散。50 min后，剩余的完整囊衣很少。柑橘囊衣主要由纖維素，半纖維素，果膠等組成，這一系列的變化證實(shí)了該種粗酶液在柑橘囊衣降解中的有效性，有效地降解了柑橘囊衣的細(xì)胞壁，表明它含有相關(guān)的降解酶。

2.2 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

為了探討草酸青霉WX-209所產(chǎn)酶在柑橘罐頭加工應(yīng)用中的安全性，進(jìn)行了毒理學(xué)測(cè)試。灌胃粗酶液結(jié)束后連續(xù)觀察14 d小鼠未見異常反應(yīng)及死亡，試驗(yàn)結(jié)束對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，肉眼觀察主要臟器表面和切面均未見明顯異常情況。酶液組與空白對(duì)照組比較，給受試物前后動(dòng)物體質(zhì)量無明顯差異（P＞0.05）；在第4、7、10、14 天，酶液組動(dòng)物體質(zhì)量與空白對(duì)照組相比，差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核和精子畸形試驗(yàn)

陽性對(duì)照組按40mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，各受試物給粗酶液體積均為20 mL/kg，高劑量組均灌胃給予原液，中劑量組劑量為高劑量的1/2，低劑量組劑量為高劑量的1/4，空白對(duì)照組給予純水。酶液各劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核率與空白對(duì)照組比較，無顯著差異（P＞0.05），陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.01），各劑量組PCE/NCE比值未小于空白對(duì)照組的20%，表明酶液對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞未見明顯毒性。酶液各劑量組小鼠精子畸形率分別與空白對(duì)照組比較，無顯著差異，陽性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較有顯著差異（P＜0.01）。

2.4 亞慢性毒性試驗(yàn)

進(jìn)行30 d口服毒理學(xué)測(cè)試，以評(píng)估粗酶液對(duì)各器官系統(tǒng)的慢性毒性作用。在喂養(yǎng)的30 d內(nèi)，酶液組小鼠的生長(zhǎng)狀況良好。動(dòng)物體質(zhì)量、食物利用率、每周總食物利用率均與對(duì)照組無顯著差異（P＞0.05）。同樣，酶溶液組的異常行為和中毒癥狀、血液學(xué)和血液生化指標(biāo)與對(duì)照組相比也沒有明顯差異（P＞0.05）。盡管中性粒細(xì)胞（Neu）和淋巴細(xì)胞（Lym）的比例分別略高于和低于對(duì)照組，但在正常范圍內(nèi)。肝臟、腎臟、脾臟、睪丸的重量及臟體比值與空白對(duì)照組比較無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 全基因組測(cè)序和組裝

使用PacBio RS系統(tǒng)和Illumina MiSeq技術(shù)的組合對(duì)草酸青霉WX-209的基因組進(jìn)行測(cè)序?；蚪M的一般特征的分析，最終組裝的WX-209的完整基因組序列以36618721個(gè)堿基對(duì)的基因組大小表示，并組裝成45個(gè)支架，GC含量為48.33%。100%鑒定的基因在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了注釋，74.84%（8508）和79.52%（9041）的基因分別在Swiss-prot和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了注釋。此外，根據(jù)COG分析，86.32%（9814）基因被注釋為不同的功能類別。根據(jù)GO注釋，將8270個(gè)基因（72.74%）分為三組。根據(jù)京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析，4708個(gè)基因（41.41%）被劃分為不同的代謝途徑。

2.6 草酸青霉WX-209所產(chǎn)酶相關(guān)的功能基因注釋

對(duì)WX-209的COG分析將9814個(gè)基因分為24個(gè)不同的類別，如圖5所示。WX-209的主要類別是碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（G，6.95%），氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝（E，5.61%），翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，表達(dá)（O，4.97%），轉(zhuǎn)錄（K，4.94%），翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（J，4.24%），能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（C，3.96%），復(fù)制，重組和修復(fù)（L，3.76%），細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)（U，3.62%)。特別是，與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的碳水化合物運(yùn)輸和代謝（G）中的基因數(shù)量為682個(gè)，其中最豐富的COG是COG0176，其對(duì)戊糖-磷酸途徑中代謝物的平衡很重要，功能注釋的高度多樣性表明， WX-209具有纖維素降解的潛力。

在GO分類分析中，8270個(gè)預(yù)測(cè)蛋白，6369，5143，6150個(gè)蛋白與分子功能，細(xì)胞成分和生物過程密切相關(guān)。與碳水化合物代謝水解酶相關(guān)的GO包括GO：0003824，GO：0016020，GO：0044425，GO：0009987和GO：0008152（對(duì)應(yīng)的基因?yàn)間ene07610，gene07894，gene08493，gene10012，gene10460，gene10511和gene10711）?；颍╣ene01275，gene04598，gene05822，gene06325，gene06631，Gene06756，gene07120，gene09398和gene09399）與α-葡萄糖苷酶的功能密切相關(guān)。gene00517，gene04336，gene04496，gene05720，gene06654，gene11604和gene11728與β-半乳糖苷酶有關(guān)。與β-1,4-木聚糖酶相關(guān)的基因包括基因01251，基因03061，基因04288，基因04893，基因05850和基因07094。

將4708種蛋白質(zhì)與KEGG途徑對(duì)應(yīng)，46條途徑中12條代謝途徑（M），12條人類疾病途徑（HD），10條有機(jī)體系統(tǒng)途徑（OS），5條細(xì)胞過程途徑（CP），4條遺傳信息處理途徑（GIP）和3條環(huán)境信息處理途徑（EIP）顯著富集。碳水化合物代謝涉及134個(gè)基因，包括氨基糖和核苷酸糖代謝（ko00520，41個(gè)基因）、淀粉和蔗糖代謝（ko00500，29個(gè)基因）、丙酮酸鹽代謝（ko00620，16個(gè)基因，戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化（ko00040，15個(gè)基因）和果糖和甘露糖代謝（ko00051，12個(gè)基因）。在以前的研究中提到的ko00500與纖維素1,4-β-纖維素生物苷酶的降解和代謝有關(guān)。草酸青霉WX-209富含與纖維素酶和木聚糖酶相關(guān)的基因，對(duì)柑橘囊衣的降解具有良好的作用。通過全基因組測(cè)序和功能注釋，我們對(duì)酶的產(chǎn)生機(jī)制有了進(jìn)一步的理解。

2.7 碳水化合物活性酶（CAZy）鑒定

根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性，活性碳水化合物酶可分為六類：糖苷水解酶類（GHs），糖苷轉(zhuǎn)移酶類（GTs），多糖裂解酶類（PLs），碳水化合物酯酶類（CEs），碳水化合物結(jié)合模塊（CBMs）和輔助模塊酶類（AAs）。草酸青霉CAZymes蛋白質(zhì)編碼基因（PEG）的Blastp分析顯示，糖苷水解酶類是最主要的類別（GH，266個(gè)基因，44.93%），其次是35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶（GT，125個(gè)基因，21.11%），11個(gè)碳水化合物酯酶（CE，115個(gè)基因，19.43%），13個(gè)輔助模塊酶（AA，57個(gè)基因，9.63%），13個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊酶類（CBM，22個(gè)基因，3.72%）和6個(gè)多糖裂解酶（PL，7個(gè)基因，1.18%）參與碳水化合物代謝。