廢用性肌肉萎縮是骨骼肌長(zhǎng)期不受負(fù)荷引起形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變的一種機(jī)體變化，可由禁食、臥床、肢體制動(dòng)、失神經(jīng)、失重等原因?qū)е?，同時(shí)也是心血管病、糖尿病等多種疾病的常見(jiàn)并發(fā)癥。根據(jù)2016全球疾病負(fù)擔(dān)報(bào)告所述，肌肉相關(guān)疾病是影響健康壽命損失年(YLD)的重要因素之一，近十年全球患肌肉相關(guān)疾病的人數(shù)比九十年代翻了一倍，且年齡標(biāo)準(zhǔn)化率增加60.7％。這一疾病不僅影響患者生活質(zhì)量，嚴(yán)重時(shí)可帶來(lái)生命危險(xiǎn)，也為國(guó)家財(cái)政帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此尋找合適有效的治療肌肉萎縮的方法或進(jìn)行早期預(yù)防，對(duì)臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)和航天醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的科學(xué)意義及社會(huì)意義。

廢用性肌肉萎縮主要表現(xiàn)為肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的降低、肌纖維變細(xì)或消失。大量研究表明，肌肉質(zhì)量的多少是由蛋白質(zhì)合成與蛋白質(zhì)分解動(dòng)態(tài)平衡決定的。當(dāng)分解速率超過(guò)合成速率、蛋白質(zhì)凈生成量減少時(shí)，發(fā)生肌肉萎縮。蛋白質(zhì)代謝信號(hào)通路的核心物質(zhì)是Akt(蛋白激酶B，PKB)?？刂频鞍踪|(zhì)合成的重要途徑是由IGF-1介導(dǎo)的IGF-1／P13K／Akt／mTOR，可激活下游信號(hào)4EBPl和S6K1轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的翻譯作用，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。控制蛋白質(zhì)分解的兩條重要途徑有泛素蛋白酶體途徑和自噬溶酶體途徑，其中肌肉萎縮相關(guān)基因和萎縮基因均由Akt的下游Fox03控制。當(dāng)它具有活性時(shí)，可從細(xì)胞質(zhì)自由進(jìn)入核中，與MAFbx／Atrogin-l和MuRFl基因的多個(gè)啟動(dòng)子相互作用，增加這兩種泛素連接酶E3的表達(dá)，促進(jìn)由二者催化的泛素蛋白酶體途徑的進(jìn)行，或通過(guò)影響溶酶體白噬途徑，加速蛋白質(zhì)分解。此外，肌肉萎縮的發(fā)生也會(huì)伴隨氧化應(yīng)激的出現(xiàn)。此時(shí)，機(jī)體內(nèi)抗氧化物酶如SOD、GSH-Px濃度降低，ROS大量增多至超過(guò)機(jī)體處理能力，直接或間接導(dǎo)致蛋白質(zhì)損傷，使細(xì)胞、組織或器官受損。

目前，除運(yùn)動(dòng)及功能訓(xùn)練外，治療肌肉萎縮的方法主要有藥物干預(yù)和營(yíng)養(yǎng)干預(yù)。藥物包括激素類(如生長(zhǎng)激素、胰島素樣生長(zhǎng)因子、中藥類、丹參、黃芪、抗氧化劑類(維生素E)等。但由于可能具有的潛在副作用，還需大量毒理實(shí)驗(yàn)證實(shí)，因此營(yíng)養(yǎng)干預(yù)方法受到越來(lái)越多的人們廣泛的關(guān)注。這些營(yíng)養(yǎng)干預(yù)方法普遍從增加蛋白質(zhì)合成、減少蛋白質(zhì)分解或改善氧化應(yīng)激等方面緩解肌肉萎縮癥狀。Beasley、夏志等研究表明，攝入富含亮氨酸等支鏈氨基酸的優(yōu)質(zhì)蛋白如乳清蛋白，可改善骨骼肌丟失的狀況并可減輕體內(nèi)引發(fā)的炎癥反應(yīng)。Bueno等發(fā)現(xiàn)，給予病人包含益生元的營(yíng)養(yǎng)組合物，可增加HMB內(nèi)源性產(chǎn)生，進(jìn)而增加mTOR濃度從而促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。Murata等發(fā)現(xiàn)攝入花翠素可通過(guò)抑制MuRF-1表達(dá)起到預(yù)防肌肉萎縮的作用。Valcarce等研究發(fā)現(xiàn)，給予小分子PPAR-δ可通過(guò)增加肌纖維的線粒體密度增強(qiáng)有氧能力，治療肌肉萎縮。

大豆多肽是大豆蛋白酶解成的小分子產(chǎn)物，必需氨基酸齊全且平衡，同時(shí)較大豆蛋白更易消化吸收，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。目前關(guān)于大豆多肽對(duì)機(jī)體的功能性研究主要集中在抗氧化。治療燒傷、降血壓、調(diào)節(jié)血糖等方面，對(duì)蛋白質(zhì)合成和分解的作用鮮有報(bào)道。因此，本文通過(guò)建立大鼠尾吊模型模擬失重，對(duì)大豆多肽對(duì)蛋白質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激的影響進(jìn)行深入探討，以期為營(yíng)養(yǎng)干預(yù)預(yù)防和治療肌肉萎縮的方法提供一定參考。

一、材料與方法

1、材料與儀器

SPF級(jí)8周齡Wistar雄性大鼠(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016—0006，體質(zhì)量260～280g)北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；大鼠維持飼料斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司；大豆多肽(蛋白含量90％)諾利如一(安陽(yáng))生物科技有限公司；IGF-1ELISA檢測(cè)試劑盒、Fox03ELISA檢測(cè)試劑盒、SODELISA檢測(cè)試劑盒北京方程生物科技有限公司；普通RIPA裂解液(組織／細(xì)胞)北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒、ECL免疫印跡底物賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；兔抗MAFbx／Fbx32／Atrogin-1單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔lgG艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

玻璃勻漿器。北京半夏科技發(fā)展有限公司；AllegraX一30R離心機(jī)美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；InfiniteM200Pro多功能酶標(biāo)儀帝肯(上海)貿(mào)易有限公司；PowerPac通用電泳儀、Trans—BlotTurbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、ChemiDocMP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）動(dòng)物分組及灌胃設(shè)計(jì)

將35只大鼠分籠飼養(yǎng)，每天晝夜循環(huán)光照12h，環(huán)境溫度20～25℃，相對(duì)濕度50％～60％。自由進(jìn)食進(jìn)水，每天更換飼料和飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取15只用于驗(yàn)證大豆多肽預(yù)防作用實(shí)驗(yàn)，設(shè)為地面一對(duì)照組1(C1)、尾吊一對(duì)照組(M)、尾吊一肽組(T)，每組5只，灌胃40d；剩余20只用于驗(yàn)證大豆多肽治療作用實(shí)驗(yàn)，其中隨機(jī)選取5只作為地面一對(duì)照組(C2)，15只進(jìn)行尾吊。飼養(yǎng)40d后，將15只尾吊大鼠放回地面，分為尾吊后一高劑量肽治療組(HT)、尾吊后一中劑量肽治療組(MT)、尾吊后一低劑量肽治療組(LT)，每組5只，與C2共同灌胃60d。參照Morey—HoltonE等的方法進(jìn)行尾部懸吊，使大鼠后肢離地30ο、前肢可自由活動(dòng)，隨大鼠生長(zhǎng)及時(shí)調(diào)節(jié)尾吊高度。按照人體每天額外補(bǔ)充5g大豆多肽進(jìn)行換算得到大鼠每天補(bǔ)充量并以此作為治療中劑量，即0.45g／(kg·BW·d)，治療高劑量和低劑量分別設(shè)為0.75g／(kg·BW·d)和0.15g／(kg·BW·d)。預(yù)防劑量設(shè)為0.30g／(kg·BW·d)。所有大鼠均按照0.50mL／(kg·BW-d)進(jìn)行灌胃，對(duì)照組灌胃蒸餾水。

（2）血清和肌肉樣品采集

預(yù)防實(shí)驗(yàn)中，于5、10、17、25、32、40d稱量大鼠體質(zhì)量并記錄。治療實(shí)驗(yàn)中，每周第4d和第7d稱量大鼠體質(zhì)量并記錄，并于7、21、35d進(jìn)行尾靜脈取血。預(yù)防實(shí)驗(yàn)灌胃40d時(shí)，對(duì)C1、M、T組進(jìn)行解剖。治療實(shí)驗(yàn)灌胃60d時(shí)，對(duì)C2、HT、MT、LT組大鼠進(jìn)行解剖。解剖前禁食不禁水12h。解剖時(shí)，麻醉后采用腹主動(dòng)脈法取血。將血液室溫靜置1～2h，于4℃放置一夜。次日4℃、3000r·min^-1離心10min，取上層血清，-80℃保存?zhèn)溆?。取大鼠左?cè)后肢腓腸肌和比目魚(yú)肌，分別稱量腓腸肌和比目魚(yú)肌濕重并計(jì)算腓腸肌和比目魚(yú)肌濕重／體質(zhì)量比：腓腸肌或比目魚(yú)肌濕重／體質(zhì)量比(mg／g)=腓腸肌或比目魚(yú)肌濕重／72鼠體質(zhì)量，于-80℃凍藏備用。

(3)血清相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

采用雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清中IGF-1、Fox03、SOD濃度。向包被對(duì)應(yīng)待測(cè)物捕獲抗體的微孔中依次加入標(biāo)準(zhǔn)品／樣品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，37℃溫育1h，洗滌未結(jié)合的抗原抗體。加入底物TMB于37℃避光孵育30min進(jìn)行顯色，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品中對(duì)應(yīng)待測(cè)物濃度。

（4）總蛋白提取及蛋白定量

取0.1g肌肉組織剪碎，加入lmLRIPA裂解液(PMSF濃度為1mmol／L)，在冰水浴條件下用玻璃勻漿器研磨10min，冰上裂解30min。于4℃、12000r·min“離心10min，收集上清即提取的總蛋白，制得肌肉勻漿樣品，于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎肂CA法對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行蛋白定量，BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=0.6892x+0.0100，決定系數(shù)R2=0.9991。最終將樣品統(tǒng)一稀釋成同一蛋白濃度。

(5)WesternBlot分析

將樣品于100℃煮沸5min使蛋白充分變性，采用12％的十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濃縮膠濃度為5％。初始電壓為80V，20min后將電壓調(diào)至120V，約1h停止。將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5％BSA中(溶于TBST)于37℃封閉2h，在1：1000稀釋的一抗中于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5Bin。加入HRP標(biāo)記的二抗于37℃孵育2h，TBST洗膜3次，每次5min。加入ECL化學(xué)發(fā)光底物對(duì)條帶進(jìn)行染色，避光結(jié)合2min，在凝膠成像儀中對(duì)目的蛋白Atrogin-1和內(nèi)參蛋白GAPDH進(jìn)行顯影，利用ImageLab軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3、數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件中單因素方差分析(One-wayANOVA)的Turkey多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果以“x±s”表示，P＜0.05或P＜0.01時(shí)判斷組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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相關(guān)鏈接：十二烷基硫酸鈉，丙烯酰胺，蛋白酶