2.5不同加工方式對石斛堿的影響

石斛通常以其新鮮或干燥莖入藥，對其加工方式主要有煎煮、榨汁、干燥、潤蒸、粉碎以及制成各種石斛藥品或石斛保健品，如復(fù)方石斛片、石斛夜光丸、石斛花茶等。不同的加工方式會導(dǎo)致石斛制品中藥效成分含量的不同。朱南南等研究發(fā)現(xiàn)，貴州赤水4個基地的金釵石斛干品和鮮品中石斛堿含量各有高低，但經(jīng)過配對t檢驗(yàn)處理，發(fā)現(xiàn)整體上差異不顯著；錢桂敏等研究發(fā)現(xiàn)，不同的干燥方法對金釵石斛中石斛堿含量影響依次為冷凍干燥法(0.45%)＞傳統(tǒng)烘干法(0.43%)＞熱風(fēng)循環(huán)干燥法(0.42%)；黎恩立首次對金釵石斛進(jìn)行超微粉碎加工，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超微粉和普通粉的多糖溶出率分別為0.2848g/g和0.1936g/g，而石斛堿的溶出率分別為0.0035g/g和0.0033g/g；孫蕓等在小議石斛的煎煮方式時提到，石斛中的有效成分主要為難溶于水的生物堿，故為了提高石斛的臨床療效，建議在煎藥時先煎1～2h后再與其他藥一起煎煮，以免造成不必要的浪費(fèi)；歐德明等研究發(fā)現(xiàn)，不同炮制方法對石斛堿含量的影響依次為白酒潤蒸(0.28%)＞蒸制品(0.23%)＞黃酒潤蒸(0.23%)＞黃酒炙品(0.22%)＞白酒炙品(0.22%)＞石斛干品(0.18%)。

由此可見，酒是較好的溶劑，能顯著提高生物堿等藥用植物中多種有效成分的溶出率，因此，在對藥用石斛加工時，建議可先以酒炙方法進(jìn)行炮制，以增加其有效成分的溶出率，縮短煎煮的時間。同時，使用超微粉碎技術(shù)對石斛屬植物進(jìn)行加工，雖然石斛堿的得率差異不大，但是卻大大提升了石斛多糖的溶出率，而且普通粉和超微粉表現(xiàn)出相似的紅外光譜吸收，說明其有效成分在超微粉碎過程中并沒有被破壞，故超微粉碎技術(shù)也不失為藥用石斛屬植物的一種有效加工方式。隨著現(xiàn)代加工技術(shù)的不斷發(fā)展，石斛屬植物的加工方式也在不斷地進(jìn)行著改進(jìn)和完善，特別是其干燥方式。建議將來可對傳統(tǒng)的單一加工技術(shù)以不同的方式進(jìn)行組合優(yōu)化，以達(dá)到生產(chǎn)成本與產(chǎn)品質(zhì)量之間的穩(wěn)態(tài)平衡，進(jìn)一步提高中草藥植物藥用功效成分提取利用率。

3石斛堿的合成途徑

自1970年Kaneko等首次以二氫黃蒿萜酮為起始材料合成了石斛堿的三環(huán)骨架結(jié)構(gòu)以來，對石斛堿的人工合成途徑報道從未間斷。王亞蕓等對石斛堿的人工合成途徑進(jìn)行了詳細(xì)的綜述。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，對于石斛堿的人工合成途徑進(jìn)行著不斷地完善和改進(jìn)。Padwa等使用呋喃甲酸酯的IMDAF環(huán)加成/重排序列完成了(±)-Dendrobine的正式合成，將重新排列的環(huán)加合物轉(zhuǎn)化為Kende的高級中間體只需要8個步驟；Hu等利用手性催化劑(20moL%催化劑ent-8)在甲苯中反應(yīng)48h，從非手性組分的Diels-Alder反應(yīng)中得到手性產(chǎn)物，為通過Kende反應(yīng)進(jìn)行(—)-Dendrobine的對映選擇性合成開辟了新的道路；Kreis等報道了一種(—)-Dendrobine的不對稱合成途徑，總共需要18步，總得率為4.0%，大大改善了以往的任何合成途徑的產(chǎn)量；Lee等開發(fā)了一種可以快速得到石斛堿核心結(jié)構(gòu)的過渡金屬催化級聯(lián)工藝，并可避免不穩(wěn)定中間體的生成；Guo等報道了一種只需要12步(總得率：6.7%)或者11步(總得率：3.8%)對映選擇性全合成左旋石斛堿(—)-Dendrobine的方法。

20世紀(jì)70年代以來，對于石斛堿化學(xué)合成途徑的研究從未間斷，為化學(xué)合成藥物提供了較好的基礎(chǔ)。但是目前石斛堿發(fā)揮其藥用功效的主要途徑仍然以食用含有石斛堿的藥用石斛屬植物的新鮮或干燥莖為主，故如何提高石斛堿在藥用石斛屬植物中的含量仍需加以關(guān)注。

朱勝男利用茉莉酸甲酯(MeJA)、水楊酸(SA)、一氧化氮供體(SNP)三種信號分子對金釵石斛組培苗進(jìn)行處理，并比較測定其石斛堿含量，通過構(gòu)建cDNA文庫以及采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，篩選到2個參與金釵石斛中石斛堿代謝合成途徑的關(guān)鍵酶基因：托品酮還原酶基因DnTRI和DnTRII；李金玲以石斛堿含量存在顯著差異的不同時期金釵石斛莖為樣本，進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)的測序，同時構(gòu)建金釵石斛轉(zhuǎn)錄組文庫，對不同時期金釵石斛莖中的差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行分析，對DEGs的數(shù)量、功能和表達(dá)模式進(jìn)行比較分析，系統(tǒng)篩選石斛堿合成代謝途徑上的相關(guān)基因，并通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。最終篩選出5個參與石斛堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因：甲羥戊酸激酶(MVK)基因(Unigene1219)、賴氨酸甲基化酶基因(CL429)、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶(IDI)基因(CL3435)、法尼基轉(zhuǎn)移酶基因(CL11407)和半胱氨酸甲基酯酶基因(CL8067)。初步提出了石斛堿的萜類合成途徑為：先按照萜類化合物形成的共同途徑至單萜［甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑］，再按照倍半萜途徑進(jìn)行生物合成。

從植物內(nèi)生菌方面著手，研究石斛堿合成途徑也不失為一條很好的研究策略。閆浩利等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)菌根真菌MF23(Mycenasp.)處理后的組培苗石斛堿含量比對照組高15.69%。Li等結(jié)合轉(zhuǎn)錄組高通量測序以及實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)對真菌MF23影響石斛堿的作用機(jī)制進(jìn)行了探究，結(jié)果顯示，與石斛堿倍半萜骨架形成相關(guān)的乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(AACT)、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶(MVD)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和萜烯合酶(TPS21)基因在真菌MF23接種9周后表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，推測MF23可能通過調(diào)節(jié)參與甲羥戊酸途徑的基因表達(dá)來影響石斛堿的生物合成，為石斛堿合成途徑的研究奠定了基礎(chǔ)。該團(tuán)隊(duì)在近幾年中利用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)，從金釵石斛中分離克隆得到3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGS)基因：DnHMGS(KX789180)；3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)基因：DnHMGR2(KX825920)；MVD基因：DnMVD(KY626328)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，克隆到的基因均受到菌根真菌MF23的調(diào)控，為進(jìn)一步解析菌根真菌MF23對金釵石斛中石斛堿合成代謝途徑調(diào)控機(jī)制奠定了研究基礎(chǔ)。

植物的次生代謝一般都涉及很多條轉(zhuǎn)錄因子、關(guān)鍵基因及其對應(yīng)酶的相互協(xié)同表達(dá)。隨著現(xiàn)代生物分子技術(shù)的發(fā)展，對植物次級代謝產(chǎn)物合成途徑上的關(guān)鍵基因進(jìn)行超表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的生成已成為研究的熱點(diǎn)。石斛堿基本骨架為含15個碳原子、有一個五元內(nèi)酯環(huán)型倍半萜類生物堿，目前石斛堿合成途徑尚不清晰，僅見于少量對石斛堿合成途徑上關(guān)鍵酶基因相關(guān)的研究，迄今為止共篩選出11個參與石斛堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因，對于石斛堿復(fù)雜的代謝合成途徑仍需要開展大量研究工作。

4展望

在中草藥的品種、栽培、收獲、加工以及貯存等工作程序中，只有以中草藥有效成分的“質(zhì)”和“量”為前提，才能確保中草藥應(yīng)有的療效。石斛堿具有神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)、清熱止痛、抗炎癥、心血管保護(hù)、抗癌以及抗甲型流感病毒等藥用功效，具有很好的挖掘潛力與應(yīng)用前景，但我們在關(guān)注石斛堿藥用功效的同時，也應(yīng)該對其毒理性進(jìn)行相關(guān)的研究，從而能夠合理、高效地發(fā)揮其藥用價值。

雖然對影響石斛中石斛堿含量的因素已有相當(dāng)多的研究報道，但是也存在一定的局限性：(1)所收集的材料是否具有地區(qū)代表性有待考究；(2)大多數(shù)材料都是野生石斛，生長的年限無法得到統(tǒng)一控制；(3)石斛種類繁多、種質(zhì)混雜，石斛品種鑒定有待進(jìn)一步的考究；(4)檢測方法的不同也會對石斛堿的含量造成一定的影響。因此，目前研究結(jié)果只能在一定程度上根據(jù)所收集的材料對不同藥用石斛屬植物的品質(zhì)做出預(yù)測，為其新育種技術(shù)在一定程度上提供理論支持。目前，我國獲取中藥藥效成分的方法主要是依賴于從藥用植物中直接提取分離，但藥用植物的栽培易受產(chǎn)地、氣候、品種以及病蟲害等的影響，進(jìn)而導(dǎo)致藥用活性成分產(chǎn)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定。故應(yīng)加大對石斛堿在植物體內(nèi)生物合成途徑的研究力度，明確關(guān)鍵酶基因，通過基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因等手段實(shí)現(xiàn)其在植株中的高效合成，或者通過合成生物學(xué)技術(shù)實(shí)現(xiàn)石斛堿的異源生物合成，進(jìn)而提高藥用石斛屬植物中石斛堿的含量，為中藥資源的可持續(xù)利用發(fā)展提供重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。

聲明：本文所用圖片、文字來源《中國食物與營養(yǎng)》2020年12月，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

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