D₃同樣是脂溶性維生素和微囊化產(chǎn)品，在樣品中含量更低（0.5～1.0μg/g）。中國藥典二部對于D₃化學純品，用HPLC正相色譜、紅外進行鑒別。借鑒Jiao等對于牛奶中痕量維生素D用石墨烯磁性固相萃取柱純化富集樣品，HPLC法分離測定及GB5009.82-2016維生素D₃的HPLC測定的方法進行優(yōu)化改進。樣品用稀氨水超聲打破囊壁和無水乙醇溶解，再用正己烷提取后正相色譜分離鑒別。省去了石墨烯固相萃取柱純化樣品及國標法中皂化、石油醚提取、洗滌及真空干燥等繁瑣步驟。方法的檢測限為7ng/g，符合鑒別要求。經(jīng)分析，上述2種HPLC法亦能有效地證明樣品中真實存在維生素K₁和D₃。

6、鹽酸氨基葡萄糖的含量測定方法

（1）色譜分離圖

在鑒別勁骨膠囊配方中所有的功效成分后，精密稱取膠囊內(nèi)容物20mg，于三角瓶中，先加1mL乙腈使樣品濕潤分散，再加適量水超聲提取5min，取出，放至室溫，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，作為樣品溶液；精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對照品10mg，于25mL容量瓶中，先加1mL乙腈濕潤分散，用水定容至刻度，搖勻，制成400μg/mL對照品溶液的方法對其最主要的功效成分鹽酸氨基葡萄糖進行了含量測定。結果顯示，對照品及樣品色譜峰均達到基線分離，主峰只有1個，保留時間一致，峰形狹窄對稱，無雜峰干擾，符合定量要求，如圖9所示。同時此方法動相用乙腈-0.4%（mL/mL）磷酸（三乙胺調(diào)至pH3.0）（4:96，V:V）替代乙腈-離子對試劑，可提高色譜柱的使用壽命，減少管道堵塞，使測定更加簡便快捷。

（2）方法學驗證

①線性回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、方法檢測限及定量限

鹽酸氨基葡萄糖在96～1200μg/mL范圍內(nèi)呈線性關系，線性方程為Y=778.82X+6774.80，相關系數(shù)r2=0.9999，按樣品最低濃度測出的信噪比3:1確定方法的檢測限為1.2μg/mL，按信噪比10:1確定方法的定量限為3.8μg/mL。

呈直線回歸，相關性好，線性范圍寬，方法檢測限和定量限低。

②樣品測定方法精密度實驗

選定樣品某一最適濃度，重復測定6次，相對標準偏差為0.72%，說明本方法重現(xiàn)性好，精密度高。

③樣品回收率實驗

在線性范圍內(nèi)采用加標回收的方法進行測定。選定已知濃度樣品作為本底，以其濃度為1，按低、中、高，即0.5:1、1:1、1.5:1左右濃度的對照品加入本底中，每個濃度重復3次，共9個樣品。通過供試品中含量值、對照品加入量和測定值計算回收率和RSD。經(jīng)測定計算，結果見表1，低濃度平均回收率為99.78%，RSD為0.22%；中濃度平均回收率為100.40%，RSD為0.17%；高濃度平均回收率為100.01%，RSD為0.49%，具有較高的準確性。
 

7、樣品中鹽酸氨基葡萄糖含量的測定

在方法學驗證基礎上，對連續(xù)3批勁骨膠囊中鹽酸氨基葡萄糖的含量進行定量測定，產(chǎn)品各批含量基本一致，RSD為0.48%，如表2所示。說明產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，測定結果重復性好、靈敏度和精確度較高。

四、結論與討論

本研究建立了對勁骨膠囊功效成分的鑒別方法，在鹽酸氨基葡萄糖的薄層色譜鑒別中，增加了樣品用石油醚脫脂純化步驟，并在展開劑中加入茚三酮顯色劑，使展開和顯色同時進行，取得較好的效果。在白芍提取物的鑒別中，增加了樣品用正丁醇純化樣品步驟，使樣品能很好分離芍藥苷，同時在薄層中設計了對照提取物、對照藥材、對照品多個參照物，比藥典僅用1個參照物鑒別效果更具說服力和可信度。在維生素K₁和D₃的HPLC法鑒別中，樣品微囊破壁和提取同步進行，比國家標準和相關文獻有較大改進，簡化了很多繁瑣操作步驟，節(jié)省時間，節(jié)約試劑，提高鑒別效果。同時本文對HPLC法測定鹽酸氨基葡萄糖含量進行了優(yōu)化，選擇通用的C18反相柱和紫外檢測器，采用簡便的提取方法，優(yōu)化流動相的組成、比例和pH值，提高了測定精密度和準確度。上述鑒別和含量測定方法專屬性強、重現(xiàn)性好、靈敏度高，可管控產(chǎn)品質(zhì)量。

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