燕窩為雨燕科金絲燕屬鳥類分泌的唾液與其羽絨混合凝結(jié)而成的物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值豐富，具有多種生物活性。燕窩主要營養(yǎng)成分為蛋白質(zhì)、碳水化合物、唾液酸，同時(shí)含有微量的脂質(zhì)和無機(jī)元素。唾液酸是燕窩的核心物質(zhì)，是腦神經(jīng)節(jié)苷脂的有益成分。燕窩的生物活性和其消化特性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，燕窩經(jīng)過消化后抗氧化活性顯著提高，能夠保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。Ghassem等發(fā)現(xiàn)燕窩模擬消化產(chǎn)物中的多肽組分具有較高的抗氧化能力，分離純化發(fā)現(xiàn)其中PFHPY和LLGDP兩種肽能夠保護(hù)HepG2細(xì)胞免受H₂0₂誘導(dǎo)的氧化損傷。Wong等研究發(fā)現(xiàn)，消化后的燕窩具有更強(qiáng)的美白活性和成骨活性，能夠抑制酪氨酸酶的活性，減少小鼠黑色素瘤細(xì)胞巾的黑色素分泌量，同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，增加小鼠的骨強(qiáng)度和真皮厚度。

唾液酸對(duì)酪氨酸酶活性具有劑量依賴性的抑制作用，對(duì)皮膚有美白功效。多肽和唾液酸是消化產(chǎn)物中的主要功能活性成分。目前關(guān)于燕窩的研究主要集中在原料的品質(zhì)偽劣鑒定和生物活性評(píng)價(jià)，關(guān)于燕窩消化特性的研究沒有詳盡的報(bào)道。作者采用Standard法模擬燉煮燕窩體外胃腸的消化，對(duì)燕窩蛋白和碳水化合物的含量和組成進(jìn)行了全面的測(cè)定分析，為進(jìn)一步開發(fā)高胃腸消化特性的燕窩新產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

燕窩：市售；胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma公司產(chǎn)品：鼠李糖，半乳糖，甘露糖，鄰苯二胺鹽酸鹽，國藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品：氨基葡萄糖、D-半乳糖胺鹽酸鹽、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸：上海創(chuàng)賽有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

傅立葉紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司：PowerPac^TMBasicPowerSupply基礎(chǔ)電泳儀電源：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司產(chǎn)品：搖擺式高速萬能粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司產(chǎn)品：DL-5-A低速臺(tái)式大容量離心機(jī)、KDN-08C數(shù)顯溫控消化爐：上海新嘉電子有限公司產(chǎn)品：UV-2802紫外可見分光光度計(jì)：尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品：KDN-103F凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司產(chǎn)品：高效液相色譜儀Waters2695(Waters2475熒光檢測(cè)器、Waters2998紫外檢測(cè)器)：美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

燕窩研磨成粉末，用60目篩子過濾，收集過濾粉末，裝袋，-20℃貯藏。

1.3.2 模擬體外消化過程

利用Standard法模擬胃腸消化：稱量0.8g燕窩粉末，溶于10mL水中，沸水水浴1h，冷卻至室溫。將燕窩溶液與10mL的模擬胃液混合于50mL離心管內(nèi)，37℃恒溫振蕩水浴，HCl調(diào)節(jié)pH使其始終保持在2.0±0.2，在100r/min的速度下模擬胃階段消化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)做一個(gè)消化管，每隔30min依次用堿液調(diào)節(jié)pH至8.0滅酶，以4500g離心分離上清液，-20℃貯藏，分析0，30，60，90，120min的消化情況。胃消化結(jié)束后，進(jìn)入小腸消化階段。加入16mL模擬腸液，NaOH調(diào)節(jié)pH使其始終保持在7.0±0.2，補(bǔ)水使體系達(dá)到40mL。繼續(xù)在100r/min的攪拌速度、37℃的溫度下進(jìn)行腸階段體外消化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)單獨(dú)做一個(gè)消化管，每隔30min將一個(gè)離心管進(jìn)行沸水浴滅酶，4500g離心分離，上清液-20℃貯藏，離心沉淀物進(jìn)行凍干儲(chǔ)藏，分析150，180，210，240min的消化情況。

1.3.3 基本成分測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照國標(biāo)GB5009.52016凱氏定氮法，蛋白質(zhì)折算系數(shù)6.25，分別測(cè)定燕窩原料蛋白質(zhì)含量和消化上清液中的水溶性蛋白質(zhì)含量：總糖含量測(cè)定：參照國標(biāo)GB/T15672—2009苯酚硫酸法，葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，分別測(cè)定燕窩原料總糖含量和消化上清液中的總糖含量。

1.3.4 水解度測(cè)定

參考楊文博等人的方法，采用甲醛滴定法。

水溶性蛋白質(zhì)水解度(％)=p×V/m(1)

式中：P為消化上清液中游離氨基酸態(tài)氮質(zhì)量濃度，g/mL：V為消化液體積，mL；m為消化上清液巾的燕窩蛋白總氮質(zhì)量，g。

1.3.5 多肽測(cè)定方法

參考GB31645—2018膠原蛋白肽的測(cè)定。色譜條件：TSKgelG2000SWXL300min×7.8mm：柱溫：30℃：流動(dòng)相：乙腈：水：三氟乙酸，體積比為40:60:0.05。檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器220nm；流量：0.5mL/min；進(jìn)樣體積10μL。

1.3.6 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法

采用NicoletiS50FTIR型傅立葉變換紅外光譜儀測(cè)定。掃描次數(shù)32次，入射角45°，掃描波數(shù)范圍4000～600cm^-1，分辨率為4cm^-1。測(cè)試樣品粉末衰減全反射紅外光譜(ATR-FTIR)，每個(gè)樣品重復(fù)采集3次。

1.3.7 唾液酸測(cè)定方法

參考袁玲和張肩偉等人的方法，采用領(lǐng)苯二胺(OPD)柱前衍生法測(cè)定燕窩原料和消化上清液的唾液酸含量。

取50mg原料溶解在40mL的體積分?jǐn)?shù)1％磷酸溶液中，沸水浴水解20min，冷卻后加入20mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1mL，80℃避光水浴40min，水系濾膜過濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

游離態(tài)唾液酸測(cè)定,取1mL液體樣品，加入20mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1mL,50℃避光水浴2.5h，改變溫度至4℃繼續(xù)衍生48h，水系濾膜過濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

聚糖態(tài)唾液酸測(cè)定，取1mL液體樣品，按體積比1:1加入Sevage試劑(V(三氯甲烷)：V(正丁醇)=4:1)反復(fù)萃取除去蛋白質(zhì)，加入20mg/mL的鄰苯二氨鹽酸鹽溶液1mL，80℃避光水浴40min，水系濾膜過濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

蛋白態(tài)唾液酸測(cè)定，取1mL消化上清液酸解，測(cè)定清液中唾液酸總量。

未溶解唾液酸測(cè)測(cè)定，取50mg燕窩消化后的離心沉淀物，溶解在40mL的1％體積分?jǐn)?shù)磷酸溶液中，沸水浴水解20min，80℃避光水浴40min，水系濾膜過濾，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

1.3.8 單糖測(cè)定方法

參考戴軍等人方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定燕窩原料和消化上清液的單糖組成。

1.3.9 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定方法

取消化液與上樣緩沖液等體積均勻混合，100℃加熱3min變性處理，8000r/min離心3min。還原電泳條件：10g/dL分離膠，5g/dL濃縮膠，上樣量10μL。對(duì)燕窩糖蛋白中的蛋白和糖鏈分別進(jìn)行單獨(dú)染色，考馬斯亮藍(lán)R-250進(jìn)行蛋白染色，高碘酸-席夫堿法進(jìn)行糖染色。ImageLab圖像軟件用于SDS-PAGE凝膠分析。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，采用SPSSl9.0和Origin8.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

相關(guān)鏈接：鼠李糖，三氟乙酸，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，鄰苯二胺鹽酸鹽

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