苦蕎麥俗稱苦蕎，學名韃靼蕎麥(Fagopyrumtataricum)，是一年生或多年生宿根植物，起源于中國西南部，生長范圍遍布亞洲、歐洲和北美洲?？嗍w麥屬于藥食兩用作物，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素及各種礦質(zhì)營養(yǎng)元素，具有極高的營養(yǎng)價值；同時與其他糧食作物相比，其富含黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抑菌、降血糖、抗腫瘤等生理功能。

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是常見的引起食物中毒的食源性致病菌，糞腸球菌是人畜共患病原菌且耐藥性嚴重：志賀氏菌是細菌性痢疾最為常見的病原菌，藤黃微球菌會引起腦膜炎、肺炎等。隨著抗生素在人類和動物疾病治療及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大量使用，耐藥性問題日益嚴重，天然植物源抑菌劑以其天然、安全、高效等特性已成為研究熱點。已有研究表明，黃酮類化合物對許多病原微生物具有廣譜抑菌特性，鑒于其不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)勢，深入研究含有黃酮類的天然植物源活性成分對于天然抑菌劑及抗菌藥物的研發(fā)具有至關重要的作用。有研究表明苦蕎麩皮中含有大量黃酮類化合物，其黃酮含量約為苦蕎粉的5倍，但由于其口感粗糙、食味苦澀且不易消化，所以在苦蕎制品加工過程中多被丟棄，加工利用率低。

目前，對苦蕎麩皮黃酮類化合物的研究多涉及苦蕎麩皮黃酮提取工藝的優(yōu)化及苦蕎麩皮黃酮含量的檢測，對苦蕎麩皮黃酮類的抗菌活性研究較少。為探究苦蕎麩皮黃酮類化合物對常見病原菌的抗菌活性，提高苦蕎麩皮資源的利用效率，作者選取了大腸桿菌、志賀氏桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、腸球菌等6株病原菌作為供試菌，采用平板打孔法及二倍稀釋法檢測苦蕎麩皮黃酮粗品和精品的抗菌性能，通過高效液相色譜法分析粗品與精品黃酮類化合物的成分及含量區(qū)別，并在測定黃酮單體抗菌活性的基礎上，討論了其主要成分的構效關系，以期為苦蕎麩皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦蕎麩皮原料：四川環(huán)太生物科技股份有限公司產(chǎn)品；蘆丁標準品、山奈酚標準品(純度均≥98％)：上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品；山奈酚-3-0-蕓香糖苷標準品、異槲皮苷標準品(純度均≥98％)：成都普思生物科技股份有限公司產(chǎn)品；槲皮素標準品(純度≥98％)：Sigma公司產(chǎn)品；LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂：Biofroxx公司產(chǎn)品。

供試菌種：金黃色葡萄球菌(StaphylOCOCUSaureus，ATCC25922)：藤黃微球菌(Micrococcusluteus.CMCC28001)：耐久腸球菌(Enterococcusdurans)：大腸桿菌(Escherichiacoli，ATCC25922)；志賀氏菌(Shigellacastellani)；腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis，CVCC3377)。上述指示菌株均為作者所在實驗室保藏菌種。

HZK-FA210型電子天平：福州華志科學儀器有限公司產(chǎn)品：SL502N型分析天平：上海民橋精密儀器科技有限公司產(chǎn)品：YLD-2000型電熱恒溫鼓風干燥箱：上?，橀_實驗設備有限公司產(chǎn)品：YRE-301旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責任公司產(chǎn)品：凈品級ADS-7型大孔吸附樹脂：天津浩聚樹脂科技有限公司產(chǎn)品；LC-16型高效液相色譜儀：日本島津公司產(chǎn)品；PS-06A型超聲波清洗機：東莞市潔康超聲波設備有限公司產(chǎn)品；UV-2600型紫外可見分光光度計：日本島津公司產(chǎn)品：LDZX-30KB型立式蒸汽壓力滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品：1389型生物安全柜：美國Thermo公司產(chǎn)品：SKY-211C型恒溫搖床：美谷分子儀器有限公司產(chǎn)品；DZKW-D-4恒溫水浴鍋：上海蘇坤實業(yè)有限公司產(chǎn)品；HPS一250型恒溫培養(yǎng)箱：哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦蕎麩皮總黃酮制備方

取苦蕎麩皮適量，參照文獻提取工藝條件：料液質(zhì)量體積比1g:10mL，乙醇體積分數(shù)70％，提取溫度60℃熱回流提取3h，重復提取3次，合并提取液并減壓濃縮至干，即得苦蕎麩皮黃酮粗品。以苦養(yǎng)麩皮黃酮粗品加適量水樣品制成上樣液，通過ADS-7型大孔吸附樹脂進行動態(tài)吸附，用體積分數(shù)90％乙醇作為洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液減壓濃縮至干，即得苦蕎麩皮黃酮精品。

1.2.2 抑菌活性測定

（1）總黃酮樣品的制備

用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑，稱取苦蕎麩皮黃酮粗品及精品各5g，加入5mLDMSO，超聲輔助溶解，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，配成質(zhì)量濃度1g/mL藥液。

（2）制備指示菌平板

將供試細菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。取對數(shù)生長期的供試細菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150r/min條件下培養(yǎng)過夜。取活化好的供試菌種，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液澄清度，將菌液濃度調(diào)至0.5麥氏單位，約1×108CFU/mL。參照譚才鄧等的方法，使用預加菌液傾注平板法制備試驗平板。向20mL冷卻至50℃左右的LB固體培養(yǎng)基中接種1mL菌懸液，混合均勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，水平靜置。

（3）打孔法測定抑菌活性

通過平板打孔法測定抑菌圈直徑。待指示菌平板冷卻凝固后，用外徑為8mm的打孔器打孔(孔間距不少于25mm，孔中心距平皿邊緣不少于15mm)。用無菌針頭小心挑去培養(yǎng)基小塊，孔中滴加少量體積分數(shù)0.5％瓊脂封底。向各孔中分別加入苦蕎麩皮黃酮粗品(質(zhì)量濃度1μL)、苦蕎麩皮黃酮精品(質(zhì)量濃度1μL)、DMSO各80μL，對應做好標記，置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。采用十字交叉法測定抑菌圈直徑，每組實驗重復3次。

1.2.3 最低抑茵濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測定

（1）樣品的制備

將苦蕎麩皮黃酮精品及粗品用DMSO溶液配制成質(zhì)量濃度200mg/mL的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，用液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋成質(zhì)量濃度100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56mg/mL；4種黃酮單體分別用DMSO溶液配制成質(zhì)量濃度50mg/mL的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾，用液體培養(yǎng)基依次倍比稀釋成質(zhì)量濃度25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39mg/mL。

（2）菌懸液制備

將供試細菌接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。取對數(shù)生長期的供試細菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150r/min條件下培養(yǎng)過夜。取活化好的供試菌種，用無菌生理鹽水調(diào)整菌液澄清度，將菌液濃度調(diào)至0.5麥氏單位，約l×l0⁸CFU/mL。

（3）MIC及MBC測定

采用二倍稀釋法進行最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定。分別吸取100μL母液及梯度稀釋樣品于96孔板的2-9孔內(nèi)。每個孔中分別加入100μL稀釋至l×l0⁸CFU/mL的菌懸液。第10孔；OH200μL液體培養(yǎng)基作為陰性空A對照，第11孔加100μL菌液和100μL液體培養(yǎng)基為陽性空A對照。將96孔板置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24h后，通過肉眼比對發(fā)現(xiàn)微孔內(nèi)液體澄清透明經(jīng)震蕩后仍無沉淀產(chǎn)生，則此微孔對應的藥液濃度即為此樣品對供試細菌的最低抑菌濃度(MIC)。將無細菌生長的微孔中液體吹打混勻后取100μL涂布于無菌培養(yǎng)基平板，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h，仍無菌落生長的最低藥物濃度為樣品的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.4 高效液相色譜法測定

（1）標準品溶液制備

稱取蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚標品粉末適量于EP管中，甲醇充分溶解，再各管吸取適量標準品溶液進行混合，0.22μm微孔濾膜過濾。

（2）樣品溶液制備

精密稱取苦蕎麩皮黃酮粗品及精品10mg，10mL甲醇充分溶解，0.22μm微孔濾膜過濾。

（3）色譜條件

參照文獻方法進行改進。IntersustainC18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動相為乙腈(A)-0.2％磷酸(B)，梯度洗脫(0～25min，15％～25％A；25～35min，25％～50％A；35～45min，50％～90％A；45～55min，90％A)；體積流量1.0mL/min：柱溫35℃；檢測波長360nm；進樣量20μL。檢測后與混合標準品進行對比。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均為3次重復實驗的均值，數(shù)據(jù)用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析，計算其均值與標準差。

相關鏈接：金黃色葡萄球菌，槲皮素，山奈酚，異槲皮苷

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