2.4 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水中有機酸含量的影響

表4顯示了屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿水過程中乳酸、醋酸、酒石酸等9種有機酸的變化。結果表明，在新鮮豆腐黃漿水中丁二酸含量最高，檸檬酸含量次之，接下來為醋酸、酒石酸、蘋果酸和乳酸，馬來酸和富馬酸含量很低，草酸含量最低，未檢出。

2.5 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水中大豆異黃酮組成和含量的影響

大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次級代謝產(chǎn)物，具有抗腫瘤、預防心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、改善婦女更年期綜合征等多種功效。大豆異黃酮共有12種異構體，以游離型黃酮苷元（Aglycones）和結合型糖苷（Glycosides）2種形式存在。苷元型大豆異黃酮主要包括染料木素（Genistein）、黃豆黃素（Glycitein）和大豆苷元（Daidzein）；糖苷型大豆異黃酮主要包括染料木苷（Genistin）、大豆黃素苷（Glycitin）、大豆苷（Daidzin）以及它們各自的乙?；咸烟擒蘸捅Ｆ咸烟擒昭苌铩?/p>

天然存在的大豆異黃酮主要以結合型β-葡萄糖苷的形式存在，這種形式的大豆異黃酮較難被人體吸收；游離苷元型大豆異黃酮不僅具有更高的生物活性，而且更容易被腸道吸收。

研究了屎腸球菌R2的發(fā)酵作用對豆腐黃漿水中染料木苷、大豆黃素苷、大豆苷、染料木素、大豆苷元及黃豆黃素含量的影響，結果如圖4所示。在新鮮豆腐黃漿水中大豆異黃酮總量為245.17mg/L，其中糖苷型大豆異黃酮含量為175.12mg/L，這與賀云的結果一致，即大部分大豆異黃酮以結合型糖苷的形式存在。

新鮮豆腐黃漿水經(jīng)過屎腸球菌R2的發(fā)酵作用后，其大豆異黃酮組分的存在形式及含量都發(fā)生了變化。結果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，糖苷型大豆異黃酮含量逐漸降低，苷元型大豆異黃酮含量明顯升高，這表明屎腸球菌R2能夠促進糖苷型大豆異黃酮向苷元型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化。發(fā)酵36h后，低活性糖苷型異黃酮含量顯著減少（P＜0.05），其含量下降到23.40mg/L；其中大豆苷和染料木苷在發(fā)酵24h后含量為零，全部轉(zhuǎn)化，而大豆黃素苷的含量變化相對較??；同時，游離型苷元異黃酮的含量顯著增加（P＜0.05），由70.05mg/L增加到115.21mg/L；其中大豆苷元含量由25.43mg/L增加至43.17mg/L，染料木素含量由24.90mg/L增加至50.16mg/L，黃豆黃素含量由19.72mg/L增加至21.88mg/L。

發(fā)酵24h后染料木苷和大豆苷已被完全轉(zhuǎn)化，但是24h后染料木素和大豆苷元的含量仍在增加（P＜0.05），說明還存在丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷，當原有的染料木苷和大豆苷消耗完以后，這兩種丙二酰葡萄糖苷轉(zhuǎn)化成相應的β-葡萄糖苷后又繼續(xù)向苷元型異黃酮轉(zhuǎn)化。另外，經(jīng)過屎腸球菌R2的發(fā)酵作用，大豆異黃酮總量由245.17mg/L下降到138.60mg/L，可能是因為大豆苷轉(zhuǎn)化成大豆苷元后，在屎腸球菌R2的作用下又進一步轉(zhuǎn)化成雌馬酚。雌馬酚是大豆異黃酮重要的代謝終產(chǎn)物，由大豆苷元在腸道菌的作用下經(jīng)特異性代謝得到，具有較異黃酮前體更高的生物活性，且性質(zhì)穩(wěn)定，容易被人體吸收。姜雪從女性體內(nèi)篩選出1株可以轉(zhuǎn)化大豆苷元生成雌馬酚的腸道菌屎腸球菌HY-1。因此，屎腸球菌R2很可能也具有將大豆苷元轉(zhuǎn)化成雌馬酚的能力。

2.6 屎腸球菌R2β-葡萄糖苷酶的定位及活性分析

研究表明乳酸菌在發(fā)酵過程中可促進豆腐黃漿中糖苷型大豆異黃酮向游離苷元型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化，這主要是β-葡萄糖苷酶的酶解作用。對屎腸球菌R2發(fā)酵過程中不同部位的β-葡萄糖苷酶酶活進行測定，結果如圖5所示，可知屎腸球菌R2具有β-葡萄糖苷酶酶活，且不同部位的酶活具有顯著差異（P＜0.05）。菌體上清中的β-葡萄糖苷酶酶活幾乎為零，破碎沉淀酶活顯著高于破碎上清酶活，說明屎腸球菌R2的β-葡萄糖苷酶屬于胞內(nèi)酶，且主要以不可溶性蛋白形式為主。這一結果與張哲的研究一致，其研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌的β-葡萄糖苷酶為胞內(nèi)酶，主要為處于細胞膜上的不可溶性酶，還有少量存在于原生質(zhì)體內(nèi)細胞液中的可溶性酶。由圖5可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，β-葡萄糖苷酶的酶活先增加后稍有下降，在發(fā)酵24h時達到最大。

2.7 發(fā)酵處理對豆腐黃漿水清除DPPH自由基能力的影響

大豆異黃酮具有很強的抗氧化活性，經(jīng)過乳酸菌的發(fā)酵作用，糖苷型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型大豆異黃酮，抗氧化活性會進一步增強。圖6為發(fā)酵黃漿水DPPH自由基的清除能力，由圖6可以看出，屎腸球菌R2發(fā)酵豆腐黃漿可顯著提高其清除DPPH自由基的能力，發(fā)酵36h后，黃漿水DPPH自由基的清除能力由14.20μgＴrolox/mL增加到55.25μgＴrolox/mL。

使用Pearson相關性檢驗對大豆異黃酮轉(zhuǎn)化與DPPH自由基清除能力進行相關性分析，結果如表5所示。結果顯示，游離型苷元大豆異黃酮大豆苷元和染料木素的含量與DPPH自由基清除能力呈顯著正相關（P＜0.05），并且染料木素的含量與DPPH自由基清除能力呈極顯著正相關（P＜0.01），同時，糖苷型大豆異黃酮大豆苷和染料木苷的含量與DPPH自由基清除能力呈顯著負相關（P＜0.05），而大豆黃素苷和黃豆黃素與DPPH自由基清除能力之間不相關（P＜0.05）。說明屎腸球菌R2發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的提高確實與大豆異黃酮的生物轉(zhuǎn)化有關，且主要因為染料木素和大豆苷元含量的增加。

3 結論

對屎腸球菌R2發(fā)酵作用對豆腐黃漿水中低聚糖、有機酸和大豆低聚糖含量以及DPPH清除能力的影響進行了研究。結果表明，屎腸球菌R2可以產(chǎn)生α-半乳糖苷酶以利用豆腐黃漿水中的碳水化合物生長產(chǎn)酸，可以有效地降解棉籽糖和水蘇糖，產(chǎn)生大量的乳酸、醋酸等有機酸，最終使pH下降到3.6以下；同時，屎腸球菌R2還可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶將活性低的糖苷型大豆異黃酮（主要為大豆苷和染料木苷）轉(zhuǎn)化為高活性游離型苷元大豆異黃酮，進而顯著提高了黃漿水清除DPPH自由基的能力。對α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶進行了初步定位，結果表明兩種酶均屬于胞內(nèi)酶，且主要為不可溶性蛋白酶，但是兩種酶的確切位置及酶活特性還需進一步研究；另外，經(jīng)過屎腸球菌R2的發(fā)酵作用，所測的大豆異黃酮總量有所下降，因此，在發(fā)酵的過程中大豆苷元很可能繼續(xù)轉(zhuǎn)化為大豆異黃酮代謝終產(chǎn)物雌馬酚，其具體的代謝機理仍需進一步探討。

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