發(fā)酵冬瓜對感染金黃色葡萄球菌小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用（一）

發(fā)布時間：2021-12-22 20:48 編輯者：特邀作者周世紅

發(fā)酵食品是一種傳統(tǒng)的食物保存方法，據(jù)《美國心臟病學院雜志》報道，發(fā)酵食品中所含的益生菌有益于心臟健康。有學者指出：發(fā)酵食品中的益生菌有利于改變腸道中的微環(huán)境，通過調(diào)節(jié)人的腸道菌群來緩解社會焦慮癥。發(fā)酵冬瓜（smellywaxgourd，SWG），又稱“臭冬瓜”，是浙東地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，因其獨特的風味而被稱為開胃菜。冬瓜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的微生物，其中優(yōu)勢菌是乳酸菌，它通過分解碳水化合物產(chǎn)生乙醇、脂肪酸和過氧化物降低了腸道的pH，抑制了細菌病原菌的生長。發(fā)酵冬瓜還產(chǎn)生可具有調(diào)節(jié)健康潛力的物質(zhì)，如維生素B、葉酸等，也合成具有神經(jīng)遞質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)功能的氨基酸及其衍生物。冬瓜在發(fā)酵中通常產(chǎn)生大量的微生物，這些微生物中有相當大一部分通過人類消化道存活。

腸道菌群是近年來人們最為關注的焦點之一，一個人的身體健康狀況不僅取決于自身的遺傳因素，而且還與人體腸道微生物組成成分密切相關。特定的飲食成分對腸道菌群的組成成分以及小分子代謝產(chǎn)物的形成具有深遠的影響，這些微生物可以直接或間接地通過腸上皮影響機體的代謝機制，當飲食發(fā)生變化時，腸道菌群結構也會發(fā)生一系列的變化。飲食影響腸道菌群，進而影響宿主的生理功能、免疫應答或生長性能。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一種廣泛分布于環(huán)境中的革蘭氏陽性球菌，在人和家畜的體表尤其在和外界相通的腔道中檢出率相當高，也是冷藏食品和鹽漬食品重要的致病性微生物，通過分泌豐富的毒力分子阻斷人體免疫反應，使得細菌逃避來自宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，造成人類廣泛的疾病，如膿皰病、菌血癥和肺炎等。盡管目前已有相關研究表明，可通過生物學方法制備特異性受體靶向作用于金黃色葡萄球菌毒素，從而達到保護機體的目的，但仍然存在諸多問題。例如，研究人員發(fā)現(xiàn)，一種特異的小分子球狀蛋白Centyrins（～10kDa），能夠靶向金黃色葡萄球菌分泌的殺白細胞素（Leukocidins），從而使宿主免受毒素侵害，但由于金葡菌具有耐藥性強、易變異等特點，使得這種單靶點治療方法失敗率較高。因此，本文嘗試采用發(fā)酵冬瓜探究其對金黃色葡萄球菌感染小鼠的緩解作用，實驗用發(fā)酵冬瓜和金黃色葡萄球菌對小鼠進行灌胃處理，利用高通量測序技術研究小鼠腸道菌群結構的變化情況，旨在為通過飲食干預治療金黃色葡萄球菌感染性腸道疾病奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4～5周齡ICR小鼠40只（20±2g），雌雄各半浙江省實驗動物中心[動物編號：1710300006，許可號：SCXK（浙）2014-0001]；冬瓜鹽胚、自然發(fā)酵的鹵水寧波三臭居公司，按固液1:1（w:v）比例混合，制成勻漿后保存在-80℃冰箱；金黃色葡萄球菌寧波大學海洋學院實驗室分離并保存；E.Z.N.A.StoolDNAKit試劑盒廣州飛揚生物工程有限公司。NanohomogenizemachineAH100D型ATS高壓均質(zhì)機ATSEngineering公司；7890A/M7-80EI型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

將選取成熟冬瓜，去皮除瓢，切成6～10cm大小的塊狀煮至七八分熟，鹽胚浸入臭鹵中，按1:1（w:v）比例混合，常溫密封發(fā)酵后，放入高壓均質(zhì)機中制成勻漿備用。金黃色葡萄球菌，在蛋白胨、牛肉膏培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)24h，稀釋成106CFU/mL懸液備用。

1.2.2 動物實驗

將實驗小鼠按性別隨機分成4組，共8組，每組5只，標記后稱重記錄初始體重。對照組（CT）每日灌胃生理鹽水（20g/kg/day），冬瓜組（SW）每日灌胃發(fā)酵冬瓜混合菌液（20g/kg/day），其中發(fā)酵冬瓜的灌胃量前期做了預實驗，發(fā)現(xiàn)對小鼠使用這個劑量能與感染金黃色葡萄球菌抗衡。金葡組（SA）每日灌胃金黃葡萄球菌液100μL，金葡+冬瓜處理組（SA+SW）每日灌胃金黃葡萄球菌液（10g/kg/day）和發(fā)酵冬瓜（10g/kg/day），連續(xù)給藥4周。每周測量體重。整個實驗過程，小鼠自由攝食和飲水，控制室內(nèi)溫度（23±1℃）和濕度（55%±10%），循環(huán)12h光照/黑暗（燈光）。小鼠灌胃4周后收集糞便于-80℃冰箱備用。

1.2.3 高通量測序

1.2.3.1 模板的制備

將糞便樣品收集后立即置于液氮中冷凍，隨后儲存至-80℃冰箱中備用。利用QIAampDNAStoolMini提取試劑盒抽提糞便DNA，使用ThermoNanoDrop2000UV-Vis測定DNA濃度和純度。

1.2.3.2 16SrDNA測序

基因組樣品用DNAQubit2.0進行精確定量后，對16SrRNA可變區(qū)（V3+V4）進行PCR擴增，預變性98℃30s，35個循環(huán)，每個循環(huán)包括：變性98℃10s，退火54℃30s，延伸72℃45s，最后延伸10min進行擴增。擴增結束后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并切膠回收，精確定量后上機測序。樣品通過Illuminamiseq測序儀進行2×300bp的雙端測序，并利用生物信息學進行分析。

1.2.4 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量測定

糞便干燥后稱取30±1mg，加入0.8mL的水，0.2mL50%的硫酸，1mL乙醚提取脂肪酸，并用氣-質(zhì)聯(lián)用儀測定。GC檢測條件：DB-WAX聚乙二醇毛細柱（60m×0.25mm×0.25μm），進樣口溫度設為250℃，檢測溫度為250℃。升溫程序。MS檢測條件：離子源溫度為230℃，監(jiān)測方式為全掃描，EI電離，掃描的質(zhì)量范圍為45～450u，掃描的時間為46min，溶劑延遲時間為7min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS20.0軟件，采用單因素方差分析（onewayANOVA）比較各組間的統(tǒng)計學差異。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用ANOVA和Tukey'sposthoctest進行分析，不符合方差分析特征的數(shù)據(jù)采用MannWhitneytest。*表示差異顯著，P＜0.05；**表示差異極顯著，P＜0.01；***表示極其顯著，P＜0.001。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群的變化

2.1.1 菌群多樣性

如圖1和圖2所示，發(fā)酵冬瓜和金黃色葡萄球菌顯著（P＜0.05或P＜0.01）提高了雄性小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。而雌性小鼠只有喂食發(fā)酵冬瓜后腸道菌群的多樣性和豐度顯著提高(P＜0.01）。通過加權主坐標分析（UniFracPCoA）發(fā)現(xiàn)喂食發(fā)酵冬瓜、金黃色葡萄球菌、金葡菌和發(fā)酵冬瓜的小鼠腸道菌群結構與對照組小鼠的腸道菌群結構存在明顯差異。