工業(yè)大麻葉對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-10-16 16:36 編輯者：特邀作者周世紅

近年來，食品安全問題日益受到關(guān)注，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。金黃色葡萄球菌，是一類球形、直徑約0.8μm、顯微鏡下呈葡萄串狀排列的革蘭氏陽性食源性病原體。S.aureus易引起乳制品、肉類、蛋類、冰淇淋等食品腐敗污染，導(dǎo)致人類食物中毒。在許多國家，病原菌食物中毒事件中，S.aureus列居第二或第三位。其引起食物中毒的主要特征是：發(fā)病迅速，通常伴有惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)敗血癥、腦膜炎和中毒性毒素休克綜合征等疾病，對(duì)于嬰幼兒、老年人、術(shù)后患者或其他體質(zhì)較虛弱的人來說，S.aureus感染具有更大的威脅圈。當(dāng)前，防止食品污染、延長(zhǎng)保質(zhì)期最簡(jiǎn)單有效的方法是使用天然或化學(xué)防腐劑。鹽、糖、醋和酒精是傳統(tǒng)的防腐劑，但一些細(xì)菌和霉菌可以耐受這些傳統(tǒng)的防腐劑。相比之下，人工合成的化學(xué)防腐劑，如苯甲酸/苯甲酸鈉、山梨酸/山梨酸鉀、硝酸鹽等，可有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，然而長(zhǎng)期攝入這些化學(xué)防腐劑可能造成毒性累積，引起過敏、頭痛等癥狀，還可能產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性。此外，一些化學(xué)防腐劑對(duì)食品感官品質(zhì)也有一定影響。如今，植物源天然產(chǎn)物憑借不同抑菌機(jī)制發(fā)揮獨(dú)特抑菌性能，其潛在功效和較少的副作用受到廣泛關(guān)注。

工業(yè)大麻俗稱火麻、漢麻，為大麻科、大麻屬的一年生草本植物，是經(jīng)遺傳改良和人工選育的無毒新品種。其四氫大麻酚(△9-THC)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.3％。多項(xiàng)研究表明，大麻對(duì)人體健康有益，可預(yù)防便秘、降低膽固醇、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、改善記憶。我國大麻資源豐富，在云南、廣西、黑龍江、吉林等地都有野生或人工栽培的大麻分布。近年來，醫(yī)用大麻二酚在癌癥治療方面的作用日益被重視，全球工業(yè)大麻種植、生產(chǎn)也不斷合法化，工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)鏈已從農(nóng)業(yè)、紡織業(yè)延伸到新材料、食品、生物醫(yī)藥等多個(gè)行業(yè)。工業(yè)大麻的種植面積逐漸增大。隨之產(chǎn)生了較多工業(yè)大麻葉副產(chǎn)物，但其利用程度有限。

多項(xiàng)研究證實(shí)工業(yè)大麻葉能有效抑制S.aureus生長(zhǎng)。雋惠玲等研究發(fā)現(xiàn)，工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus的最低抑菌濃度(MIC)為7.53mg/L；郭孟璧證實(shí)工業(yè)大麻雌株花葉多糖對(duì)S.aureus的MIC為3.125mg/L；張旭等采用超臨界C0₂萃取工業(yè)大麻中的大麻二酚(CBD)、六氫大麻酚(CBN)和四氫大麻酚(△9-THC)，這3種大麻酚的混合物對(duì)S.aureus的MIC為6mg/mL；Giovanni等研究了工業(yè)大麻葉中5種大麻素對(duì)多種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)抑菌活性的影響，發(fā)現(xiàn)大麻素的異戊二烯基主要參與脂類親和作用的調(diào)節(jié)，對(duì)抑菌作用影響較小，酚羥基的甲基化、乙?；?、前大麻素羧基的酯化以及第二個(gè)萜的引入都不利于抑菌活性，但其機(jī)制尚不明確。本課題組前期研究表明，來自大慶地區(qū)的工業(yè)大麻葉乙酸乙酯萃取物對(duì)S.aureus的MIC為7.81mg/L，且經(jīng)紫外輻射、添加蔗糖和不同溫度處理仍表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。目前，工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus抑菌的研究大多圍繞抑菌效果開展。而關(guān)于抑菌組成和抑菌機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上。對(duì)工業(yè)大麻葉萃取物進(jìn)行硅膠柱分離，評(píng)價(jià)了按不同比例的石油醚與乙酸乙酯洗脫后，萃取物各餾分對(duì)S.aureus的抑菌活性,利用GC-MS確定高活性餾分的化合物組成,進(jìn)一步分析工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

工業(yè)大麻葉：經(jīng)鑒定為火麻1號(hào)品種，于2019年7月中旬采自黑龍江省科學(xué)院大慶分院東風(fēng)農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田；金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株[ATCC25923]：上海魯微科技有限公司產(chǎn)品；硅膠粉：青島海洋生物有限公司產(chǎn)品：氨芐青霉素鈉：德國Ruibio公司產(chǎn)品；AKP試劑盒、可溶性蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒、ATP含量試劑盒：南京建成生物工程研究所有限公司產(chǎn)品；SOD試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；戊二醛固定液：福州phygene生物科技公司產(chǎn)品；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、叔丁醇(AR)：均為遼寧泉瑞試劑有限公司產(chǎn)品。

7890B-7000c氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫公司產(chǎn)品；Epoch多功能酶標(biāo)儀：美國BioTek公司產(chǎn)品；UV-759紫外可見分光光度計(jì)：上海高致精密儀器有限公司產(chǎn)品；JSM7200F掃描電子顯微鏡：日本電子公司產(chǎn)品；DDS307電導(dǎo)率儀：上海紅益儀器儀表有限公司產(chǎn)品：VFD-4500型冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品：RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工業(yè)大麻葉提取物制備

據(jù)張正海等的方法，取1.5kg陰干工業(yè)大麻葉，粉碎并過60目篩，以料液質(zhì)量體積比為1g:15mL的比例加入體積分?jǐn)?shù)為88％的乙醇，超聲輔助提取20min，真空抽濾，重復(fù)3次，合并濾液，于40℃旋蒸至膏狀(182g)。乙酸乙酯萃取，減壓濃縮后得浸膏57g，用85.5g硅膠(100。200目)拌樣后干法上樣，經(jīng)200。300目硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫(體積比分別為1:0，50:1，20:1，5:1，1:1，0:1)，根據(jù)薄層色譜(TLC)合并相似餾分，共得到Frl-Fr6共6個(gè)餾分，旋蒸后調(diào)整質(zhì)量濃度至10mg/mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾除菌后，4℃保存，用于抑菌試驗(yàn)。

1.2.2 菌懸液制備

在無菌的條件下，將活化好的S.aureus單菌落接種于已滅菌的MH培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)16h，室溫4000r/min離心后收集菌體，用無菌生理鹽水稀釋菌懸液至單位體積的菌落數(shù)為106~107CFU/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 最低抑制濃度(MIC)測(cè)定

參考Tang等和Zhou等的方法并適當(dāng)修改，采用微量2倍稀釋法，向96孔板中加入90μL/孔菌懸液和10μL，孔的工業(yè)大麻葉提取物.使其質(zhì)量濃度分別為1000、500、250、125、62.5、31.25、16、8μL，并設(shè)空白對(duì)照(不含細(xì)菌)和陽性對(duì)照(含等質(zhì)量濃度的氨芐青霉素鈉)，37℃恒溫培養(yǎng)24h，肉眼直接觀察，不出現(xiàn)渾濁的最小質(zhì)量濃度即為MIC。

1.2.4 GC-MS化學(xué)成分分析

利用Frl-Fr6篩選S.aureus的活性后，取活性最佳的餾分并分析其組成。用甲醇稀釋Fr5至質(zhì)量濃度為1mg/mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行GC-MS。GC：HP-5MS(30m×250μm，0.25μm)，He氣流量為：1.1mL/min：升溫程序?yàn)椋?00℃保持1min，以10℃/min速率升溫到280℃保持12min：MS：四級(jí)桿溫度：150℃，離子源(EI)：70eV，240℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z50.0～500.0。

1.2.5 生長(zhǎng)曲線繪制

參考Liu等的方法，按體積分?jǐn)?shù)1％的接種量將S.aureus分別接種于含0MIC、0.5MIC、1MIC的工業(yè)大麻葉提取物的培養(yǎng)基中，37℃、120r/min振蕩培養(yǎng)24h，酶標(biāo)儀每隔2h測(cè)定OD_600nm，繪制0D_600nm-時(shí)間生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 菌懸液中AKP活力、可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度圈、核酸相對(duì)濃度和電導(dǎo)率的測(cè)定

刎分別向含有0MIC、0.5MIC、1MIC的工業(yè)大麻葉提取物的培養(yǎng)基中加入菌懸液。使得菌懸液?jiǎn)挝惑w積菌落數(shù)為106CFU，mL，于37℃，振蕩培養(yǎng)，每隔2h取5mL菌液，4℃、4000r/min離心取上清液，按照各自試劑盒說明書的方法測(cè)定AKP活力和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度、紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm波長(zhǎng)下吸光值、去離子水稀釋20倍后電導(dǎo)率儀測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)電導(dǎo)率。

1.2.7 胞內(nèi)ATP濃度、SOD活性測(cè)定

分別于0、2、4、6、8、10h取1mL菌液，4℃、4000r/min離心后，棄上清液，按各自試劑盒說明書方法測(cè)定菌體ATP濃度和SOD活性。

1.2.8 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察及樣品制

備按Zhou等的方法并稍加改動(dòng)，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期S.aureus菌懸液?jiǎn)挝惑w積的菌落數(shù)調(diào)整為107CFu/mL，加入工業(yè)大麻葉提取液使質(zhì)量濃度分別為0MIC、1MIC,于37℃，120r/min振蕩培養(yǎng)10h。取800μL菌體于室溫下、4000r，min離心后棄上清液，用0.1mo‰L、pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌3次，離心收集菌體后用體積分?jǐn)?shù)為2.5％的戊二醛溶液固定過夜。依次用體積分?jǐn)?shù)為30.0％、50.0％、70.0％、80.0％、90.0％、100.0％的乙醇梯度脫水，叔丁醇置換。取細(xì)菌-叔丁醇懸浮液10μL滴于10mm×10mm硅片上，用真空冷凍干燥機(jī)干燥，噴金后SEM觀察。