2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌最小抑菌濃度的影響

在確定肉桂醇對副溶血性弧菌有抑菌活性基礎(chǔ)之上，采用二倍稀釋法測定3組副溶血性弧菌(包括UG、OMDG、CWDG)的MIC，結(jié)果見表1，細(xì)胞壁缺失可以改變副溶血性弧菌對抑菌劑的敏感性。肉桂醇對UG、OMDG和CWDG的MIC分別為原液質(zhì)量濃度的1/32、1/256和1/256。由該結(jié)果可知，丟失外膜層使菌體對肉桂醇的敏感程度增加，而進(jìn)一步丟失肽聚糖層未改變菌體對肉桂醇的敏感程度，說明外膜是肉桂醇抑制副溶血性弧菌的主要作用位點。彭志峰等曾對比土霉素和四環(huán)素對鴨源雞桿菌親本株RU和外膜孔蛋白OmpW突變株△Omp形的MIC，結(jié)果顯示，△0mp形的MIC值分別降低到RU的1/8和1/32，與本試驗結(jié)果一致。以上結(jié)果說明，外膜孔蛋白是外膜層中抑菌劑作用的靶點。

2.2 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌細(xì)胞膜完整性的影響

核酸和蛋白質(zhì)均是菌體重要的單位結(jié)構(gòu)物質(zhì)，在核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收波長處菌液吸光度值增大時，說明二者發(fā)生了外滲，表明細(xì)胞膜完整性遭受破壞。從表2中可以看出，通過不同質(zhì)量濃度的肉桂醇處理后，3組副溶血性弧菌的細(xì)胞膜均受到不同程度的破壞，并且隨著肉桂醇質(zhì)量濃度的增加，受到的破壞也越大，說明肉桂醇會作用于細(xì)菌細(xì)胞膜。當(dāng)肉桂醇質(zhì)量濃度低至1/4MIC時。對3組副溶血性弧菌的抑制作用已經(jīng)減弱，與空白組的細(xì)胞膜受損程度相近。相較于UG，OMDG和CWDG菌液中特征性吸光度值無顯著差異(P＜0.05)，表明進(jìn)一步的去除肽聚糖層對細(xì)胞膜的完整性無影響，即細(xì)胞壁中外膜層是菌體抵抗抑菌劑的主要結(jié)構(gòu)，對細(xì)胞膜的損傷有保護(hù)作用。

2.3 內(nèi)膜通透性對肉桂醇抑菌性能的影響

硫酸粘桿菌素是一種窄譜抗生素，對革蘭氏陰性菌有很強(qiáng)的抑菌作用。它先與外膜層中的脂多糖結(jié)合，破壞外膜通透性，進(jìn)而與細(xì)胞膜上脂蛋白結(jié)合，使細(xì)胞膜的通透性增加、表面張力降低，導(dǎo)致胞內(nèi)的重要物質(zhì)外滲，嚴(yán)重時引起菌體死亡例。由表3可知，在UG中，肉桂醇質(zhì)量濃度越低，菌體受到的破壞越小，內(nèi)容物滲出越少，0D值就越??；在0MDG和CWDG中,由于外膜層已被去除，細(xì)胞膜被硫酸粘桿菌素破壞，導(dǎo)致加入的肉桂醇已經(jīng)沒有可以作用的部位，因此肉桂醇質(zhì)量濃度的變化對結(jié)果無影響，故肉桂醇可能對外膜和細(xì)胞膜都有作用。

2.4 外膜蛋白SDS-PAGE

將從試驗菌株副溶血性弧菌ATCCl7802中提取的外膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE試驗，結(jié)果見圖2。共獲得10條蛋白條帶，其分子質(zhì)量大小在18.4～66.2ku之間。與之前文獻(xiàn)報道的副溶血性弧菌外膜蛋白分子量范圍相符。

2.5 外膜蛋白競爭試驗

競爭試驗主要是用來判斷肉桂醇的作用位點是否為外膜層中的外膜蛋白。由圖1計算m提取的外膜蛋白樣品的質(zhì)量濃度為512μg/mL，滿足競爭試驗中對外膜蛋白的濃度要求。將副溶血性弧菌的外膜蛋白與1/2MIC肉桂醇互混1h后再與菌體細(xì)胞共培養(yǎng).外膜蛋白以劑量依賴方式減小肉桂醇對菌體細(xì)胞的損傷作用(圖3)，這說明肉桂醇能與外膜蛋白產(chǎn)生相互作用，故菌體無法被PI染色，凋亡圖中總凋亡率隨外膜蛋白質(zhì)量濃度的增大而降低。

2.6 細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌藥物敏感性的影響

細(xì)胞壁缺失對副溶血性弧菌藥物敏感性的影響見表4。抗生素在抑菌過程中作用的靶點不盡相同，四環(huán)素和紅霉素能抑制蛋白質(zhì)的合成，萬古霉素能抑制細(xì)胞壁的合成，環(huán)丙沙星能抑制DNA的合成和復(fù)制，利福平能抑制RNA的合成。所測抗生素對UG均有效，作用于細(xì)胞壁的萬古霉素對0MDG和CWDG無效，說明處理的菌體缺失了其作用靶點。然而，利福平在接觸0MDG細(xì)胞時藥效下降，這可能是因為外膜尤其是外膜蛋白是利福平進(jìn)入菌體的通道，而在接觸CWDG細(xì)胞時藥效丟失，可能肽聚糖層也在該藥進(jìn)入細(xì)胞過程中起到一定作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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