2 結果與分析

2.1 茉莉花原生質體分離體系的優(yōu)化

為了分離到足夠量、有活力的茉莉花原生質體,本試驗采用酶解法,針對不同組織器官、不同處理方式、酶解液組合、酶解時間等因素進行了摸索和優(yōu)化。

2.1.1 不同處理方式對茉莉花原生質體分離的影響

借鑒擬南芥和番茄葉片原生質體制備方法,初步嘗試從茉莉花葉片分離原生質體,然而得到的原生質體多為細胞碎片,且形狀異常,FDA染色大部分無熒光,顯示存活率極低(圖1-A,B)。然而,以茉莉花花瓣為試材時,在相同的酶解液中可收集到形態(tài)良好,FDA處理發(fā)熒光,有活力的原生質體(圖1-C,D),因此在接下來的研究中須專注于優(yōu)化茉莉花花瓣的原生質體分離體系。

嘗試了用切絲法、膠撕法和磨砂法在酶解前分別對花瓣組織進行處理(圖2-A,B,C),以使花瓣細胞能充分接觸酶解液。在4m1相同酶解液中孵育6h后,收集觀察原生質體產量,在3次獨立重復試驗中均顯示切絲法獲得的原生質體數量最多,膠撕法次之,磨砂法得到的原生質體產量最低(圖3)?？紤]到操作的簡易性,切絲法處理茉莉花花瓣對原生質體分離最有效。

2.1.2 酶液組合和酶解時間對茉莉花原生質體分離的影響

在含4G·1^-1離析酶和2G·1^-1果膠酶的酶解液中梯度增加纖維素酶的質量濃度從5至30G·1^-1,檢測結果顯示(圖4-A),在一定濃度范圍內,原生質體產量隨纖維素酶質量濃度提高而增加,當濃度為15G·1^-1時,原生質體產量達到峰值,為1.34×106個·G^-1,死亡率為29.1％；隨著纖維素酶質量濃度繼續(xù)升高,原生質體產量和活力都開始下降,細胞破碎程度嚴重。因此,分離茉莉花花瓣原生質體較適宜的纖維素酶質量濃度為15G·1^-1。在含4G·1^-1離析酶和15G·1^-1纖維素酶的酶解液梯度增加果膠酶的質量濃度從2至10G·1^-1,花瓣原生質體產量檢測結果顯示(圖4-B),隨果膠酶濃度升高,原生質體產量同步增加,當果膠酶質量濃度為8G·1^-1時,原生質體產量最高,為1.48×106個·G^-1,死亡率較低,為31.0％,較適宜花瓣原生質體的分離.試驗表明,酶解液中最佳的纖維素酶和果膠酶質量濃度分別為15和8G·1^-1。

為進一步優(yōu)化茉莉花花瓣原生質體的分離效率,選取4個酶解時間段3、4、5、6h,采用上述優(yōu)化后的酶解液組合,檢測釋放出來的原生質體總量及死亡率。如圖4-C所示,隨著酶解時間延長,原生質體產量逐步增多,在酶解5h時,原生質體產量最高,達到2.96×106個·G^-1,死亡率為23.5％,相對較低.因此最適合酶解時間為5h。

2.2茉莉花原生質體瞬時轉化體系的優(yōu)化

本研究進一步采用PEG介導法,探討了原生質體終濃度、外源dnA含量、不同PEG處理等對茉莉花花瓣原生質體瞬時轉化效率的影響。

將收集的花瓣原生質體稀釋成不同終濃度的細胞液,經相同的轉化方法和孵育時間,熒光顯微鏡下統(tǒng)計原生質體轉化效率,結果如圖5-A所示,相同轉化體系中,外源dnA含量為100μG·m1^-1原生質體時,最適合轉化的茉莉花花瓣原生質體濃度為4×105個·m1^-1,轉化效率約78％。

向原生質體濃度為4×105個·m1^-1的轉化體系中加入不同量的P35s-GFP質粒,經相同的PEG處理和孵育時間,結果如圖5-B所示,當轉化體系中dnA含量為75μG·m1^-1原生質體時,轉化效率最佳,約為79％。

本研究分析了不同終濃度的PEG4000對茉莉花花瓣原生質體轉化效率的影響(圖5-C)。在終濃度為200G·1^-1的PEG處理下花瓣原生質體的轉化效率顯著高于其他濃度,其次是150和250G·1^-1的PEG終濃度,50G·1^-1PEG處理下原生質體轉化效率最低。

為進一步優(yōu)化轉化體系,本試驗還比較了PEG誘導時間對原生質體轉化效率的影響(圖5-D)。PEG處理時間在10min以內,原生質體轉化效率均達到70％以上,當處理時間超過15min,轉化效率顯著降低。

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