多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法是目前測(cè)定地表水中糞大腸菌群的常用標(biāo)準(zhǔn)方法,通過(guò)三種方法對(duì)糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實(shí)際地表水樣進(jìn)行分析檢測(cè),結(jié)果表明:多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法用于糞大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果具有一致性;通過(guò)三種方法優(yōu)缺點(diǎn)的對(duì)比,多管法成本低適用于常規(guī)檢測(cè),紙片法高效方便更適用于大批量快速檢測(cè),酶底物法操作簡(jiǎn)單,不受場(chǎng)地限制可直接現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),更適用于應(yīng)急現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)。

前言

糞大腸菌群又稱耐熱大腸菌群，是在44.5℃能生長(zhǎng)并發(fā)酵乳酸產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。環(huán)境地表水中的糞大腸菌群主要來(lái)自糞便的污染，因此通過(guò)測(cè)定水中糞大腸菌群的含量，可間接得出水體受糞便污染的情況，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)主要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一，是評(píng)價(jià)水體污染程度和環(huán)境衛(wèi)生的重要指標(biāo)，在《地表水環(huán)境質(zhì)量（GB3838—2002）》中，規(guī)定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ類水糞大腸菌群的含量依次≤200、200～2000、2000～10000、10000～20000及20000～40000個(gè)/L，我國(guó)地表水體糞大腸菌群含量普遍較高，部分水域含量甚至超過(guò)Ⅴ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法是目前國(guó)內(nèi)測(cè)定地表水中糞大腸菌群常用的標(biāo)準(zhǔn)方法。多管發(fā)酵法早在1985年就列入《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法（GB5750-85）》，并于2018年發(fā)布修訂版，是糞大腸菌群測(cè)定的經(jīng)典方法，它作為《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版）》中的推薦方法，美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)（APHA）出版的《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法（20版）》中方法9221E也采用的是多管發(fā)酵法；紙片法在西方發(fā)達(dá)國(guó)家運(yùn)用較少，主要在一些發(fā)展中國(guó)家使用，環(huán)保部在2015年發(fā)布了紙片法的標(biāo)準(zhǔn)方法，它作為《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法（第四版）》中的推薦方法（C類方法）；酶底物法是一種新型酶技術(shù)檢測(cè)方法，已在美、日、韓和歐洲許多國(guó)家使用,2003年從美國(guó)引入我國(guó)，環(huán)保部在2018年發(fā)布了酶底物法的標(biāo)準(zhǔn)方法。三種方法均是糞大腸菌群檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但在檢出限、檢測(cè)時(shí)間和操作過(guò)程等存在差異，本文參照環(huán)保行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，分別從糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實(shí)際地表水樣進(jìn)行檢測(cè)分析和對(duì)比研究，并從監(jiān)測(cè)時(shí)間、成本、環(huán)境等總結(jié)出各方法的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍，為廣大環(huán)境監(jiān)測(cè)分析人員根據(jù)實(shí)際條件和水樣類型選擇最佳方法分析測(cè)試提供借鑒與參考。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和材料

乳糖蛋白胨培養(yǎng)基，EC肉湯培養(yǎng)基，糞大腸紙片I、II型，糞大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，DST(deflned)MMO-MUG酶底物試劑，無(wú)菌水，陽(yáng)性菌株：大腸埃希氏菌ATCC25922，陰性菌株：產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048。

1.2儀器和設(shè)備

采樣瓶，隔水式恒溫培養(yǎng)箱：GNP-9160，恒溫培養(yǎng)箱：HH.B11.420-135-Ⅱ，高壓蒸汽滅菌器：YXQ-LS-100G，程控定量封口機(jī)：2009D,97孔定量盤(pán)，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性比色盤(pán)，接種環(huán)，1mL移液管，試管：15mm×150mm。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

多管發(fā)酵法HJ347.2—2018；紙片法HJ755—2015；酶底物法HJ1001—2018。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1空白對(duì)照

空白對(duì)照用無(wú)菌水做全程序空白測(cè)定。(1)多管發(fā)酵法：初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵的管中均無(wú)顏色變化，滿足標(biāo)準(zhǔn)空白要求；(2)紙片法：培養(yǎng)后的紙片上無(wú)任何微生物生長(zhǎng)，滿足標(biāo)準(zhǔn)空白要求；(3)酶底物法：培養(yǎng)后的97孔定量盤(pán)中無(wú)顏色反應(yīng)，滿足H標(biāo)準(zhǔn)空白要求。

2.2陽(yáng)性及陰性對(duì)照

按多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法三種方法實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行培養(yǎng)，陽(yáng)性菌株呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)。

2.3糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的結(jié)果（見(jiàn)表1)

由表1可知，三種方法對(duì)糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的六次測(cè)試結(jié)果均在可接受范圍（83～312067MPN/L）內(nèi)；從標(biāo)準(zhǔn)樣品檢測(cè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)看，多管發(fā)酵法為3.37%，紙片法為2.44%，酶底物法為1.87%，均滿足各自對(duì)應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的要求；從相對(duì)誤差來(lái)看，多管發(fā)酵法為3.72%，紙片法為2.6%，酶底物法為3.34%，均滿足各自對(duì)應(yīng)方法標(biāo)準(zhǔn)中相對(duì)誤差的要求。

2.4實(shí)際地表水樣結(jié)果（見(jiàn)表2)

18個(gè)不同環(huán)境地表水樣同時(shí)用多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法在相同條件下進(jìn)行檢測(cè)，為了使數(shù)據(jù)成正態(tài)分布，先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行取對(duì)數(shù)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用SPSS兩兩進(jìn)行雙樣本配對(duì)t檢驗(yàn)。

由表2數(shù)據(jù)可以看出，相關(guān)系數(shù)r分別為0.983、0.990、0.993，說(shuō)明三組數(shù)據(jù)相關(guān)性較好；各組的t值分別為0.056、0.124、0.247，均小于t0.05(17)=2.110，說(shuō)明三種方法對(duì)同一樣品的分析結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性差異，即多管法、紙片法和酶底物法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。

2.5三種方法的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比（見(jiàn)表3)

由表3可知，從實(shí)驗(yàn)操作來(lái)看，多管發(fā)酵法需要配置培養(yǎng)基并滅菌，進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，分析時(shí)間是48h左右、監(jiān)測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作過(guò)程煩瑣且在滅菌環(huán)境下檢測(cè)；紙片法和酶底物法均可即時(shí)接種開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，較為簡(jiǎn)便，酶底物法接種的工作量明顯比多管和紙片法少很多，效率最高，紙片法相比多管法而言無(wú)須進(jìn)行復(fù)發(fā)酵，效率比多管法高。從儀器設(shè)備來(lái)看，紙片法只需要隔水培養(yǎng)箱，多管法和酶底物法除了隔水培養(yǎng)箱外，均還需要一個(gè)設(shè)備。從經(jīng)濟(jì)成本來(lái)看，單個(gè)樣品的成本多管發(fā)酵法最低，其次為紙片法，酶底物法成本最高。

3結(jié)語(yǔ)

通過(guò)多管發(fā)酵法、紙片法和酶底物法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品和實(shí)際地表水樣的實(shí)驗(yàn)對(duì)比研究可知，同一樣品三種方法對(duì)糞大腸菌群檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異，其結(jié)果具有一致性。它們作為環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)方法，各有優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)不同的條件和要求選擇合適的方法。多管發(fā)酵法和紙片快速法已經(jīng)列為《國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測(cè)網(wǎng)監(jiān)測(cè)任務(wù)作業(yè)指導(dǎo)書(shū)（試行）》的指定方法。

綜上所述，多管發(fā)酵法應(yīng)用最為廣泛，適用于水樣稀釋倍數(shù)未知的情況和環(huán)境監(jiān)測(cè)部門(mén)的常規(guī)檢測(cè)；紙片法更適用于大批量樣品的快速檢測(cè)；酶底物法雖成本昂貴，但操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)環(huán)境沒(méi)有特殊要求，更適用于環(huán)境事故應(yīng)急監(jiān)測(cè)。

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