目的：為滿足腸道集聚性大腸埃希氏菌準確檢測的實驗室質(zhì)量控制和能力驗證需求，研制具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)且具有全基因組測序信息的均勻穩(wěn)定的腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體及gDNA標準物質(zhì)。方法：利用二代高通量測序技術(shù)對腸道集聚性大腸埃希氏菌（CMCC44841）進行全基因組測序，明確CMCC44841的種屬、血清分型、多位點序列分型和毒力基因。對CMCC44841進行astA、aggR、pic特征性基因PCR確認。采用冷凍干燥技術(shù)制備含量為103CFU/樣品的菌球和含量為20ng/樣品的gDNA小球。參照CNAS-GL017對20個菌球樣品進行均勻性檢驗，采用單因素方差分析對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。將樣品分別于-20℃、4℃、25℃和37℃條件下保藏，對其儲藏穩(wěn)定性和運輸穩(wěn)定性進行評價。組織3家實驗室進行協(xié)同標定和驗證。使用5種不同基質(zhì)的即食食品樣本，按照國標法檢驗標準物質(zhì)的適用性。結(jié)果：利用生物信息學分析，CMCC44841基因組大小為5.057285Mb，GC含量為50.6%，編碼區(qū)基因5173個。種屬鑒定結(jié)果為大腸埃希氏菌（Escherichiacoli），血清預測結(jié)果為O127:H21，MLST為ST40型，攜帶除aggR、astA、pic之外其他相關(guān)的毒力基因。PCR擴增出astA、aggR、pic片段大小分別為102bp、400bp和1111bp。菌體標準物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果F=1.59，符合標準物質(zhì)的要求。菌體和gDNA標準物質(zhì)樣品于-20℃和4℃保藏60d，25℃保藏7d，37℃保藏5d后仍然穩(wěn)定。經(jīng)3家實驗室協(xié)同標定，菌體標準物質(zhì)樣品含量均為103CFU/樣品。20件不同基質(zhì)的食品樣品加入腸道集聚性大腸埃希氏菌標準物質(zhì)進行檢驗，均可以檢出。結(jié)論：本研究所制備的腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體及gDNA標準物質(zhì)所用菌株來源于我國國內(nèi)分離菌株，且具有明確的全基因組序列信息，均勻性和穩(wěn)定性均符合要求，適用性良好，能夠滿足食品檢測實驗室的質(zhì)量控制和能力驗證的需求。

致瀉性大腸埃希氏菌所引起的腹瀉是世界范圍內(nèi)存在的一個重要的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)毒力因子、致病機理和流行病學特征，致瀉性大腸埃希氏菌可分為5類：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic Escherichiacoli,EPEC）、腸道產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive Escherichiacoli,EIEC）以及腸道集聚性大腸埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichiacoli,EAEC）。EAEC是一類新發(fā)現(xiàn)的致瀉性大腸埃希氏菌，已在世界各國引起散發(fā)或暴發(fā)。美國國立衛(wèi)生研究院已將EAEC歸為B類生物恐怖病原體。我國各省市致瀉大腸埃希氏菌流行特征分析結(jié)果顯示，EAEC在食源性致瀉大腸埃希氏菌中最常見，為主要毒力基因型。因此食品中EAEC快速準確的檢測工作對預防和控制由其引起的細菌性食物中毒事件有著非常重要的作用。

EAEC傳統(tǒng)的鑒定方法包括分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學鑒定和16SrDNA鑒定等，這些方法實驗周期較長，且存在一定的局限性。目前PCR技術(shù)由于其靈敏度高可靠性強等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于EAEC的檢測中。國家標準GB4789.6-2016規(guī)定對生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進行集聚熱穩(wěn)定性毒素A基因（enteroag gregative heat-stable enter otoxin A,astA）、集聚黏附菌毛調(diào)節(jié)基因（aggregative adhesive fimbriaere gulator,aggR）、腸定植因子基因（proteininvolve dinintestinal colonization,pic）三個特征性基因的PCR鑒定，每次PCR反應(yīng)需要使用EAEC標準菌株及其gDNA作為陽性對照，以保證結(jié)果的準確性。由于復雜的食品基質(zhì)背景、培養(yǎng)基、試劑、DNA提取、人員操作等原因可直接影響檢測結(jié)果的準確性，所以在檢測過程中需要穩(wěn)定的微生物標準物質(zhì)和DNA標準物質(zhì)對整個檢驗過程進行質(zhì)量控制，從而保證檢測數(shù)據(jù)的準確性和有效性。目前國內(nèi)對于EAEC菌體標準物質(zhì)及其基因組DNA（genomic DNA，gDNA）標準物質(zhì)并未見相關(guān)的研究報道。

自21世紀初，基因測序技術(shù)取得突破性進展，基因測序獲得的數(shù)據(jù)量、測序速度和費用都得到大幅度改觀。在國內(nèi)，單個微生物基因組測序的費用也從數(shù)萬元降低至目前幾百元。通過對食源性微生物基因組進行測序、組裝，能夠獲得90%以上的細菌DNA信息，包括種屬、耐藥基因、毒力因子、轉(zhuǎn)移元件等信息，可對多個細菌間的基因組信息進行比對分析，在細菌鑒定、耐藥機制和溯源等研究中發(fā)揮重要的作用。

本研究針對目前檢驗領(lǐng)域需求，利用高通量測序技術(shù)對腸道集聚性大腸埃希氏菌CMCC44841進行全基因組測序，研制基因組信息背景清晰、穩(wěn)定性良好的即用型腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體和gDNA兩種標準物質(zhì)，不僅能夠應(yīng)用于食品檢測機構(gòu)的質(zhì)量控制和人員考核，而且可為我國食品安全檢測水平進一步提高、及時發(fā)現(xiàn)問題提供有力的技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料與試劑

腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）CMCC44841來源于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptosesoyaagar,TSA）美國BD公司；生理鹽水國藥集團；細菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP日本Takara；瓊脂糖Oxoid。

1.2儀器與設(shè)備

FreeZone12L冷凍干燥機德國LABCONCO公司；PL2002電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Thermo1389生物安全柜、205050GC恒溫培養(yǎng)箱、冷凍離心機、NanoDrop2000微量核酸蛋白測定儀、Qubit熒光定量測定儀美國Thermo公司；FORMA恒溫搖床西班牙IUL公司；VITEKCompact2自動微生物分析系統(tǒng)法國梅里埃公司；Autoflex飛行質(zhì)譜德國Bruker公司；C1000PCR儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)美國伯樂公司。

相關(guān)鏈接：大腸埃希氏菌，毒素，聚合酶，標準物質(zhì)

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