油茶葉提取物的5α-還原酶抑制活性及化學(xué)成分分析（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-05-09 20:12 編輯者：夏德婷

5α-還原酶（5α-Reductase,5α-R）是重要的雄性激素代謝酶，睪酮（Testosterone,T）在5α-還原酶（5α-R）的作用下不可逆地轉(zhuǎn)化雙氫睪酮（Dihydrotestosterone,DHT），過(guò)程中還要依賴(lài)還原性輔酶II（NADPH），如圖1所示。DHT是最強(qiáng)的活性雄性激素，因?yàn)樗c雄性激素受體（Androgenreceptor,AR）的親和性比T高2~5倍，誘導(dǎo)AR信號(hào)傳導(dǎo)的效力比T高10倍可引發(fā)雄性激素依賴(lài)性疾病比如痤瘡、雄激素源性脫發(fā)、女性多毛癥、前列腺癌、前列腺增生、假兩性畸形等。

5α-R是皮膚中最重要的雄性激素代謝酶，它具有三種同工酶，其中I型和II型酶的特征比較清楚，二者的主要區(qū)別為5α-RI主要存在于肝臟及非生殖器官皮膚，其發(fā)揮生理作用的最適pH為范圍較寬為6~9，而5α-RII主要存在前列腺、睪丸、附睪、精囊、頭皮毛囊等，其最適pH為5.5。

目前已開(kāi)發(fā)的5α-R抑制劑包括甾體類(lèi)和非甾體類(lèi)，最常見(jiàn)藥物如非那雄胺、度他雄胺、愛(ài)普列特等。但這些藥物存在不良反應(yīng)，如代表性藥物非那雄胺可能對(duì)男性造成，抑郁、焦慮、認(rèn)知障礙、勃起障礙、性欲減退、男性乳房女子化、肌肉生長(zhǎng)受損等副作用，統(tǒng)稱(chēng)為非那雄胺后綜合征（Post-finasteridesyndrome,PFS）。

這些副作用是這類(lèi)藥物本身固有的，難以通過(guò)改造結(jié)構(gòu)來(lái)消除，因此從天然植物中尋找安全、有效且來(lái)源廣泛的5α-R抑制劑替代這些化學(xué)合成的抑制劑己成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Niederprüm等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了鋸葉棕果實(shí)提取物具有5α-R抑制活性以及治療前列腺增生的效果。WeisserH等發(fā)現(xiàn)鋸葉棕提取物IDS89對(duì)人前列腺上皮和間質(zhì)中的5α-R具有抑制作用，且屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，有效成分是可皂化亞組分中的月桂酸，它對(duì)上皮和基質(zhì)的最大抑制率分別為52％和45％。鄧桂球等從雌性大鼠肝臟、雄性大鼠附睪組織中分別提取I型、Ⅱ型5α-R，采用HPLC法測(cè)定出紅花提取物對(duì)I型、Ⅱ型5α-R活性均有抑制效果，抑制率分別達(dá)到88.12%和61.65%。另外也有研究報(bào)道大黃非洲臀果木、大蕁麻、薰衣草、蓮子心等植物的提取物具有良好的5α-R抑制活性，是天然來(lái)源的5α-R抑制劑。

油茶葉是山茶科植物油茶CamelliaOleifera的葉，《中華本草》中提到其味微苦，性平，有治療鼻衄，皮膚潰爛瘙癢，瘡疽的功效。羅曉偉等已經(jīng)證明油茶蒲具有5α-R抑制活性，油茶葉與油茶蒲同為油茶的重要組成部分，推測(cè)油茶葉與油茶蒲可能具有類(lèi)似的生物活性。本文以5α-R為研究靶點(diǎn)，旨在探究油茶葉提取物對(duì)5α-R活性的影響，探討其成為潛在的5α-R抑制劑的可能性，并分析其化學(xué)成分，為其在治療雄性激素依賴(lài)型疾病如痤瘡、前列腺癌等提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮采摘的油茶葉，浙江省江山市江山之間生物科技有限公司提供；SPF級(jí)別雄性大鼠4只，體重（200±20）g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，許可證編號(hào)SCXK（浙）2019-0002；還原型輔酶II，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，上海碧云天；度他雄胺、睪酮、沒(méi)食子酸、蘆丁分析對(duì)照品，上海阿拉丁；色譜級(jí)甲醇等有機(jī)試劑均來(lái)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

高效液相色譜Waterse2695，美國(guó)Waters公司沃特世；LunaC18(2)色譜柱（4.6mm×250mm,5μm），美國(guó)Phenomenex公司；UltimateUHPLCLP-C18色譜柱（2.1mm×150mm,1.8μm），上海月旭；AcquityTMUltra型超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；SciexTripleTOF5600+四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)ABSciex公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1粗酶提取物的制備以及5α-R含量的測(cè)定

參考張蓓的方法并稍作修改，取雄性大鼠4只，禁食不禁水過(guò)夜后脫臼處死。迅速取肝臟，剝離脂肪組織，稱(chēng)重，剪碎，置于燒杯，加入預(yù)冷的提酶緩沖液（提酶緩沖液：0.32mol/L蔗糖；0.1mmol/LDTT；1mmol/LEDTA；20mmol/L磷酸鹽緩沖液pH7.4）按照1:4（w/v）的比例在冰水浴中用勻漿器勻漿，制成勻漿液，然后將其分裝至離心管，在4℃、10,000×g條件下離心20min，除去漂浮的脂肪，取上層液體，同樣條件下再離心1h，上清液即為微粒體粗提取物。采用Bradford法對(duì)粗酶提取物定量，以其總蛋白質(zhì)含量表示5α-R的含量。

1.2.25α-R酶促反應(yīng)體系的建立與5α-R活性測(cè)定

1.2.2.1T標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

配制系列濃度T溶液：5μmol/L~2000μmol/L，將不同濃度T溶液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾至液相瓶，進(jìn)入高效液相色譜儀檢測(cè)，以峰面積A（AU*min）為縱坐標(biāo)，以T濃度C（μmol/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

液相色譜條件：

色譜柱：LunaC18(2)柱（4.6mm×250mm,5μm）不銹鋼柱；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇/水70/30（V/V）；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：242nm；進(jìn)樣體積：20μL。

1.2.2.25α-R酶促反應(yīng)體系的建立

在1000μL測(cè)活體系中，將300μLPBS緩沖液（pH7.4）、500μL粗酶提取物稀釋液、50μLT、50μL50%乙醇、100μLNADPH按順序添依次加至離心管，于旋渦混合儀快速混合均勻3s，37℃恒溫水浴鍋反應(yīng)30min，在t0時(shí)刻與t30時(shí)刻快速分別取樣400μL，快速加入800μL甲醇（甲醇起到失活蛋白酶的作用），渦旋5s終止反應(yīng)。上述反應(yīng)液在12,000r/min離心15min，除蛋白，取上清液，0.22μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾至液相瓶，待檢測(cè)。

1.2.2.35α-R活性測(cè)定

HPLC檢測(cè)比較反應(yīng)前t0時(shí)刻與反應(yīng)后t30時(shí)刻T峰面積的變化，液相色譜條件同1.2.2.1。將T峰面積帶入T標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出相應(yīng)濃度，以及T濃度的變化量，從而實(shí)現(xiàn)測(cè)定5α-R的活性。設(shè)置不同的反應(yīng)管包括：空白對(duì)照管（酶提取物用甲醇失活）、酶正常反應(yīng)管、陽(yáng)性對(duì)照管（50%乙醇換成度他雄安溶液）。

計(jì)算公式如下：

△T（μmol/L）=Ct0–Ct30（1）

Ct0表示0min時(shí)T濃度，Ct30表示30min時(shí)T濃度，△T表示反應(yīng)前后T濃度的差值。

5α-R活性（μmolT/gprot·30min）=（Ct0–Ct30）/C5α-R（2）

定義5α-R活性（μmolT/gprot·30min）為每克酶提取物每30min轉(zhuǎn)化T的量，C5α-R（g/L）表示5α-R粗提取物的濃度，即5α-R粗提取物蛋白質(zhì)的濃度。

1.2.35α-R酶促反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.2.3.1反應(yīng)體系中NADPH、T、粗酶提取物適宜添加濃度的確定

將NADPH用PBS配制成一系列梯度：0.5mmol/L、1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L，采用1.2.2中提到的5α-R活性測(cè)定方法，在固定5α-R提取物濃度為0.76mg/mL、T濃度為1mmol/L的條件下，以5α-R活性為指標(biāo)，考察NADPH的適宜添加濃度。

將T配制成一系列梯度：0.025mmol/L、0.1mmol/L、0.4mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L，采用1.2.2中提到的5α-R活性測(cè)定方法，在固定5α-R提取物濃度為0.76mg/mL，NADPH濃度為2mmol/L的條件下，以5α-R活性為指標(biāo)，考察T的適宜添加濃度。

以蛋白質(zhì)濃度表示粗酶提取物的濃度，將其用PBS（pH7.4）緩沖液稀釋成系列梯度：0.38mg/mL、0.76mg/mL、1.52mg/mL、3.03mg/mL、6.06mg/mL，采用1.2.2中提到的5α-R活性測(cè)定方法，在固定T濃度為2mmol/L，NADPH濃度為2mmol/L的條件下，以5α-R活性為指標(biāo)，考察粗酶提取物的適宜添加濃度。

1.2.3.2反應(yīng)體系穩(wěn)定性的考察

確定最終反應(yīng)體系各個(gè)組分的濃度條件：76mg/mL粗酶提取物500μL，2mmol/LT50μL，樣品50μL，2mmol/LNADPH100μL，分別測(cè)定四次空白對(duì)照管和酶正常反應(yīng)管的T濃度變化，考察反應(yīng)體系的重復(fù)性和穩(wěn)定性，計(jì)算相對(duì)偏差RSD。

1.2.3.3度他雄胺5α-R抑制活性的測(cè)定

度他雄胺是Ⅰ型5α-R抑制劑，將其為陽(yáng)性藥物并稀釋成系列梯度：2nmol/L、4nmol/L、6nmol/L、8nmol/L、12nmol/L、16nmol/L，采用1.2.2中提到的5α-R活性測(cè)定方法，在適宜的NADPH濃度、T濃度、粗酶提取物濃度條件下，把50%乙醇溶液替換成系列濃度的度他雄胺溶液，考察不同濃度度他雄胺對(duì)5α-R活性的抑制率，繪制抑制曲線(xiàn)，計(jì)算出度他雄胺對(duì)5α-R活性的半抑制濃度（IC50），公式如下：