目前現(xiàn)行標注是(5009.33-2016)食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定，標準中規(guī)定了3種方法：第一法 離子色譜法、第二法 分光光度法、第三法 蔬菜、水果中硝酸鹽的測定 。紫外分光光度法目前大多數(shù)企業(yè)會選擇使用第二法分光光度法。

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測定,硝酸鹽采用鎘柱還原法測定。試樣經(jīng)沉淀蛋白質(zhì)、除去脂肪后,在弱酸條件下,亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸重氮化后,再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料,外標法測得亞硝酸鹽含量。采用鎘柱將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,測得亞硝酸鹽總量,由測得的亞硝酸鹽總量減去試樣中亞硝酸鹽含量,即得試樣中硝酸鹽含量。

一、試劑及標準溶液的配制

試劑配制：

1 亞鐵氰化鉀溶液(106g/L):稱取106.0g亞鐵氰化鉀,用水溶解,并稀釋至1000mL。 

2 乙酸鋅溶液(220g/L):稱取220.0g乙酸鋅,先加30mL冰乙酸溶解,用水稀釋至1000mL。 

3 飽和硼砂溶液(50g/L):稱取5.0g硼酸鈉,溶于100mL熱水中,冷卻后備用。 

4 氨緩沖溶液(pH9.6~9.7):量取30mL鹽酸,加100mL水,混勻后加65mL氨水,再加水稀釋 至1000mL,混勻。調(diào)節(jié)pH 至9.6~9.7。 

5 氨緩沖液的稀釋液:量取50mLpH9.6~9.7氨緩沖溶液,加水稀釋至500mL,混勻。 

6 鹽酸(0.1mol/L):量取8.3mL鹽酸,用水稀釋至1000mL。 

7 鹽酸(2mol/L):量取167mL鹽酸,用水稀釋至1000mL。 

8 鹽酸(20%):量取20mL鹽酸,用水稀釋至100mL。 

9 對氨基苯磺酸溶液(4g/L):稱取0.4g對氨基苯磺酸,溶于100mL20%鹽酸中,混勻,置棕色 瓶中,避光保存。 

10 鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L):稱取0.2g鹽酸萘乙二胺,溶于100mL水中,混勻,置棕色瓶中, 避光保存。 

11 硫酸銅溶液(20g/L):稱取20g硫酸銅,加水溶解,并稀釋至1000mL。 

12 硫酸鎘溶液(40g/L):稱取40g硫酸鎘,加水溶解,并稀釋至1000mL。 

13 乙酸溶液(3%):量取冰乙酸3mL于100mL容量瓶中,以水稀釋至刻度,混勻。

標準溶液的配制：

亞硝酸鈉(NaNO2,CAS號:7632-00-0):基準試劑,或采用具有標準物質(zhì)證書的亞硝酸鹽標準 溶液。

1 亞硝酸鈉標準溶液(200μg/mL,以亞硝酸鈉計):準確稱取0.1000g于110 ℃~120 ℃干燥恒 重的亞硝酸鈉,加水溶解,移入 500mL容量瓶中,加水稀釋至刻度,混勻。

2 亞硝酸鈉標準使用液(5.0μg/mL):臨用前,吸取2.50mL亞硝酸鈉標準溶液,置于100mL容 量瓶中,加水稀釋至刻度。

二、樣品預(yù)處理

1 乳粉、豆奶粉、嬰兒配方粉等固態(tài)乳制品(不包括干酪):將試樣裝入能夠容納2倍試樣體積的帶蓋容器中,通過反復(fù)搖晃和顛倒容器使樣品充分混勻直到使試樣均一化。 

2 發(fā)酵乳、乳、煉乳及其他液體乳制品:通過攪拌或反復(fù)搖晃和顛倒容器使試樣充分混勻。 

3 干酪:取適量的樣品研磨成均勻的泥漿狀。為避免水分損失,研磨過程中應(yīng)避免產(chǎn)生過多的熱量。

沉淀蛋白質(zhì)、去除脂肪，提取制備待測液：

1 干酪:稱取試樣2.5g(精確至0.001g),置于150mL具塞錐形瓶中,加水80mL,搖勻,超聲30min,取出放置至室溫,定量轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加入3%乙酸溶液2mL,加水稀釋至刻度,混勻。于4℃放置20min,取出放置至室溫,溶液經(jīng)濾紙過濾,濾液備用。

2 液體乳樣品:稱取試樣90g(精確至0.001g),置于250mL具塞錐形瓶中,加12.5mL飽和硼砂溶液,加入70 ℃左右的水約60mL,混勻,于沸水浴中加熱 15min,取出置冷水浴中冷卻,并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L 亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5mL220g/L乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,濾液備用。 

3 乳粉:稱取試樣10g(精確至0.001g),置于150mL具塞錐形瓶中,加12.5mL50g/L飽和硼砂溶液,加入70℃左右的水約150mL,混勻,于沸水浴中加熱 15min,取出置冷水浴中冷卻,并放置至室溫。定量轉(zhuǎn)移上述提取液至200mL容量瓶中,加入5mL106g/L 亞鐵氰化鉀溶液,搖勻,再加入5mL220g/L乙酸鋅溶液,以沉淀蛋白質(zhì)。加水至刻度,搖勻,放置30min,除去上層脂肪,上清液用濾紙過濾,棄去初濾液30mL,濾液備用。

三、標準曲線制作及亞硝酸鹽測定

吸取40.0mL 上述濾液于50mL 帶塞比色管中,另吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、 0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50 mL 亞硝酸鈉標準使用液(相當于0.0μg、1.0μg、2.0μg、 3.0μg、4.0μg、5.0μg、7.5μg、10.0μg、12.5μg亞硝酸鈉),分別置于50mL 帶塞比色管中。

于標準管與試樣管中分別加入2mL4g/L對氨基苯磺酸溶液,混勻,靜置3min~5min后各加入1mL2g/L鹽酸萘乙二胺溶液,加水至刻度,混勻,靜置15min,用1cm比色杯,以零管調(diào)節(jié)零點,于波長538nm處測吸光度,繪制標準曲線比較。同時做試劑空白。

四、亞硝酸鹽含量計算

式中: 

X1 ——試樣中亞硝酸鈉的含量,單位為毫克每千克(mg/kg); 

m2 ——測定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量,單位為微克(μg); 

1000——轉(zhuǎn)換系數(shù); 

m3 ——試樣質(zhì)量,單位為克(g); 

V1 ——測定用樣液體積,單位為毫升(mL); 

V0 ——試樣處理液總體積,單位為毫升(mL)。 

五、 精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。此方法亞硝酸鹽檢出限:液體乳0.06mg/kg,乳粉0.5mg/kg,干酪及其他1mg/kg。結(jié)果保留2位有效數(shù)字。

六、注意事項

①樣品必須粉碎均勻，以便充分提取；

②顯色時，必須按順序添加對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺，不得顛倒順序；

③認真判定樣品的濾液是否澄清、透明、無干擾色；若有干擾色必須進行樣品空白扣除實驗；

④比色管和容量瓶等這些玻璃器材應(yīng)該用稀鹽酸浸泡24小時，然后用蒸餾水沖洗干凈，然后倒扣在比色管架子上，控水，讓比色管自然晾干。

⑤用在紫外分光光度計上的比色皿應(yīng)該處理干凈，處理的方法是浸泡在重鉻酸鉀溶液中，也可以浸泡在乙醇鹽酸溶液中，這樣處理比色皿就比較干凈了。

⑥紫外分光光度計應(yīng)該做好暗電流校正，應(yīng)該提前預(yù)熱半個小時才能使用，預(yù)熱的目的是讓機器更穩(wěn)定，數(shù)據(jù)更加的準確。

⑦在配制磺胺等各種溶液的時候，應(yīng)該使用不含有亞硝酸鹽的蒸餾水，這樣能保證實驗的準確，能保證實驗更容易成功。

⑧在做標準曲線的時候，可以自己配制，也可以買現(xiàn)成的標準溶液，在移取的時候，可以用移液管或者是移液槍，但是要經(jīng)過檢驗合格，這是很重要的。

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