羊肉發(fā)酵香腸是用羊肉制成的香腸，是香腸中的新品種，因其加工技術成熟、方便食用和耐貯存等特點備受關注。生物胺是一種分子質量低、難揮發(fā)的堿性物質，攝入的食物中如果生物胺含量較高可能會中毒，導致頭痛、嘔吐或者腹瀉等不良癥狀出現(xiàn)。自然發(fā)酵香腸的發(fā)酵過程屬于開放式多菌種混合發(fā)酵體系，其中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物產生氨基酸脫羧酶將游離氨基酸脫羧生成相應的生物胺。

近日，西南民族大學食品科學與技術學院以不同發(fā)酵階段的羊肉香腸為實驗對象，采用高效液相色譜方法測定樣品中的生物胺含量，采用宏基因組技術分析樣品中的微生物組成及變化，對生物胺和微生物多樣性進行相關性分析，并結合非冗余（NR）蛋白質序列、直系同源蛋白分組比對（eggNOG）數據庫和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數據庫對微生物和酶的豐度與功能進行注釋，探究生物胺與微生物菌群的相關性，以及生物胺代謝與微生物和酶的關系，旨在為探究自然發(fā)酵羊肉香腸中生物胺的代謝機制提供科學依據。

1 羊肉香腸的生物胺測定結果

利用高效液相色譜分別確定了色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺和精胺的保留時間。以這8 種生物胺標準品制作不同質量濃度的混合標準品溶液，以峰面積比作為因變量，不同質量濃度（mg/L）作為自變量，繪制并得到標準曲線和方程，分別為y=0.034 9x＋0.004 3（R2=0.999 7）、y=0.693 2x-0.001 2（R2=0.999 9）、y=1.352 1x＋0.017 3（R2=0.999 8）、y=1.786 3x＋0.009 8（R2=0.999 9）、y=1.830 6x-0.002 0（R2=0.999 6）、y=1.520 2x＋0.009 0（R2=0.999 9）、y=1.755 7x-0.115 2（R2=0.999 2）和y=1.278 5x-0.088 4（R2=0.999 1）。通過標準曲線方程，計算出不同發(fā)酵階段羊肉香腸樣品中各種生物胺含量，結果如表1所示。

色胺、苯乙胺和腐胺在羊肉香腸發(fā)酵過程中差異不顯著（P＞0.05）。尸胺和組胺含量變化沒有明顯的規(guī)律，而酪胺、亞精胺和精胺均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，只是酪胺的最大值出現(xiàn)在第5天，而亞精胺和精胺最大值則是在第14天。其中，組胺最終含量為1.26 mg/kg，酪胺最終為5.07 mg/kg，總生物胺為80.42 mg/kg，自制羊肉香腸的生物胺符合報道要求組胺、酪胺和總生物胺含量的規(guī)定，香腸的安全性符合要求。在8 種生物胺中，精胺含量最高，為羊肉香腸發(fā)酵過程中的主要生物胺，14 d達到最高值97.70 mg/kg，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢；0 d與26 d的精胺含量與14 d呈顯著差異；亞精胺和精胺一般與原料肉的品質、部位以及生理狀況有關，是生物體內的生理多胺，雖然研究表明這兩種胺對人體健康沒有直接的不良影響，但可能與亞硝酸鹽反應形成致癌的亞硝胺，因此，也需要控制其含量。

2 羊肉香腸中微生物的群落結構

提取羊肉香腸樣品基因組，經宏基因組測序和去除低質量數據后，得到62 106 208 bp，包含67 377 條序列。對羊肉香腸樣品進行物種注釋，共鑒定出43 個門、60 個綱、112 個目、201 個科、465 個屬和2 156 個種的微生物。

在細菌的屬水平，豐度排名前30的細菌群落結構如圖1 所示，較直觀地展示了不同發(fā)酵階段羊肉香腸中細菌群落構成的異同。第0 天，嗜血桿菌屬（Haemophilus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、酒球菌屬（Oenococcus）、李斯特菌屬（Listeria）和弓形菌屬（Arcobacter）相對豐度較高，分別為20.39%、18.82%、10.02%、5.24%和5.20%；第5天時，樣品中相對豐度較高的細菌屬為弧菌屬（Vibrio）、葡萄球菌屬、嗜血桿菌屬、酒球菌屬和明串珠菌屬（Leuconostoc），其相對豐度分別為21.16%、17.79%、13.86%、6.50%和3.83%；到第14天時，葡萄球菌屬相對豐度達到4 組樣品的最高值，為43.95%，其次分別是嗜血桿菌屬，相對豐度為11.73%，為4 個時間點的最低值，弧菌屬的相對豐度為7.64%，酒球菌屬和李斯特菌屬的相對豐度也變?yōu)榱? 個時期的最低值，分別為6.03%和3.15%；直到第26天，與第14天相比，相對豐度較大的細菌屬類別不變，但相對豐度發(fā)生了改變，葡萄球菌屬為25.39%、嗜血桿菌屬為18.63%、酒球菌屬為8.89%、弧菌屬為4.79%、李斯特菌屬為4.70%。

說明發(fā)酵羊肉香腸中的細菌構成較為復雜，不同發(fā)酵階段的樣品中的優(yōu)勢菌屬不同，這可能是由于自然發(fā)酵這一生產方式導致?？傮w來講，在自然發(fā)酵羊肉香腸樣品中葡萄球菌屬的占比較大，這是一類常見于發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢菌，葡萄球菌可以快速還原硝酸鹽，使降解產物與肌紅蛋白結合形成亞硝基紅蛋白，賦予肉制品紅潤的色澤，同時還能夠防止脂肪氧化。樣品中具有相對豐度較高的嗜血桿菌屬，這可能與原材料有關，羊肉或者豬腸衣自身攜帶有嗜血桿菌屬，導致樣品中這種微生物相對豐度較高，可能會引發(fā)食源性疾病，因此在選擇原材料時應注意原料的品質，保證食品安全。

真菌在羊肉香腸樣品中占比較小，相對豐度排名前3 0 的真菌屬中，最大的是德巴利酵母菌屬（Debaryomyces），其相對豐度僅為0.206%，在第14天時出現(xiàn)，其余的真菌屬相比較細菌屬而言，對生物胺的作用可以忽略不計。

3 羊肉香腸中細菌屬水平結構與生物胺的相關性分析

羊肉香腸發(fā)酵過程中微生物菌群結構會發(fā)生變化，生物胺作為氨基酸脫羧的產物，其種類和含量與微生物的豐富度和多樣性密切相關。使用Spearman相關性分析研究了羊肉發(fā)酵香腸樣品中8 種生物胺和30 個優(yōu)勢細菌屬之間的關系。結果表明，明串珠菌屬、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、弧菌屬、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）和希瓦氏菌屬（Shewanella）均與尸胺呈極顯著（P＜0.01）正相關；與精胺呈顯著（P＜0.05）負相關的15 種細菌分別為李斯特菌屬、酒球菌屬、弓形菌屬、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬（Bacillus）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、短螺菌屬（Brachyspira）、彎曲桿菌屬（Campylobacter）、Eggerthia、變漿體屬（Anaplasma）、腸球菌屬（Enterococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、奈瑟氏菌屬（Neisseria）、梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）和分枝桿菌屬（Mycolicibacterium）；與亞精胺呈顯著（P＜0.05）負相關的4 種菌屬分別為李斯特菌屬、酒球菌屬、弓形菌屬和嗜血桿菌屬；與酪胺呈顯著（P＜0.05）負相關的5 種菌屬分別為李斯特菌屬、酒球菌屬、弓形菌屬、嗜血桿菌屬和泛菌屬（Pantoea），呈顯著正相關的有假交替單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬；與色胺呈顯著（P＜0.05）正相關的是葡萄球菌屬和鏈球菌屬（Streptococcus）。

4 數據庫注釋分析

4.1 eggNOG數據庫注釋分析

將11 份樣品測序得到的數據與eggNOG數據庫進行比對，獲得了每個基因對應的直系同源集（Clusters of Orthologous Groups，COG）注釋情況，共鑒定出36 935 個COG功能單元，這些功能單元分屬于23 個主要的功能大類。其中，基因數排名前3的主要是未知功能類9 190 個基因，氨基酸的轉運和代謝3 242 個基因，復制、重組和修復2 936 個基因。

4.2 KEGG數據庫注釋分析

將NR基因在KEGG數據庫中進行注釋，結果如圖4所示。11 份樣品中共有39 319 個NR基因注釋到KEGG的34 條代謝通路中，在第1水平的通路中，注釋到新陳代謝通路的數量最多，共有26 273 條；其次是環(huán)境信息處理，共6 041 條；遺傳信息處理，共3 795 條；細胞過程，共2 335 條；生命系統(tǒng)最少，僅有875 條。在新陳代謝通路的第2水平中，除4 203 條NR基因被注釋到全局和總覽圖外，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔酶因子和維生素的代謝是被注釋最多的途徑。KEGG數據庫注釋結果揭示了羊肉香腸中微生物主要通過調控碳水化合物代謝和氨基酸代謝過程影響香腸的品質，其中，與生物胺產生相關的代謝為氨基酸代謝。
不同發(fā)酵階段羊肉香腸的KEGG代謝分析

將不同發(fā)酵階段香腸樣品的KEGG數據庫中第1水平的豐富度進行繪圖后發(fā)現(xiàn)，在羊肉香腸中，共有5 大類代謝通路，不同時間的微生物基因在同一類中注釋結果存在差異，但無論在哪大類代謝通路中，第14天所比對的基因在同一類別中比例都最高，而第0天所注釋的結果比例都最低，說明第14天的5大功能最旺盛。其中，新陳代謝功能尤其突出，表明14 d是自然發(fā)酵羊肉香腸中微生物代謝活動最為旺盛的時間。

4.3 不同發(fā)酵階段羊肉香腸的新陳代謝類型分析

在新陳代謝通路的第2水平中，每個階段注釋到的第2水平所含有豐度各不相同。第0天各種代謝的豐度均低于第14天，在第0天各種代謝中能量代謝最為旺盛；在第5、14、26天時，除去NR基因被注釋到的全局和總覽圖外，碳水化合物代謝最旺盛，其次是氨基酸代謝和能量代謝。11 份樣品中共有13 條代謝通路中出現(xiàn)生物胺，從KEGG數據庫的第2水平來講屬于其中的5 類，分別為氨基酸代謝6 條，其他氨基酸代謝的代謝有2 條，能量代謝1 條，輔酶因子和維生素的代謝1 條，其他次生代謝物的生物合成有3 條。

5 與生物胺代謝相關的通路分析

羊肉香腸樣品分別結合KEGG Pathway中ko00380、ko00360、ko00350和ko00950注釋的色胺、苯乙胺和酪胺代謝通路圖。色胺、苯乙胺和酪胺都在單胺氧化酶（EC: 1.4.3.4）的作用下被降解，通過在KEGG數據庫中對酶的來源進行追蹤發(fā)現(xiàn)，單胺氧化酶主要由3 種菌產生，分別為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter sp.）YP14、假單胞菌屬OV144和嗜冷桿菌屬YGAH215。樣品去宿主基因后，與KEGG數據庫進行比對，沒有注釋到合成這3 種胺的微生物，推測樣品中色胺、苯乙胺和酪胺的形成可能是由于原料肉中內源酶的催化作用。

羊肉香腸樣品結合KEGG Pathway 中ko00310、ko00480注釋的尸胺代謝通路圖。尸胺只由微生物通過賴氨酸脫羧酶（EC: 4.1.1.18）作用于賴氨酸脫羧形成，樣品中具有這種能力的微生物只有1 種菌，為Photobacterium piscicola。尸胺降解的途徑只有1 條，涉及到的微生物有2 種（假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas sp.）JB197、半透明假交替單胞菌（Pseudoalteromonas translucida）），都是通過亞精胺合酶（EC: 2.5.1.16）降解尸胺。

結合KEGG Pathway中ko00330、ko00480注釋的腐胺代謝通路圖。合成腐胺的路徑有2 條，一條為胍基丁胺在胍基丁酶（EC: 3.5.3.11）的作用下合成腐胺，產生這種酶的微生物有3 種，分別為木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、Vibrio rumoiensis、馬葡萄球菌（Staphylococcus equorum）；另一條合成途徑是鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶（EC: 4.1.1.17）作用下脫羧形成腐胺，涉及的微生物有熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）、嗜冷桿菌屬YGAH215和嗜冷桿菌屬1501（2011）。腐胺的降解途徑有氧化、轉移等方式，其中產生carboxynorspermidine synthase（EC: 1.5.1.43）的微生物有Vibrio sp.、V. rumoiensis、噬海藻弧菌（V. algivorus），產生亞精胺合酶（EC: 2.5.1.16）的微生物有假交替單胞菌屬JB197和半透明假交替單胞菌，產生二胺N-乙?；D移酶（EC: 2.3.1.57）的微生物有Vibrio sp.、Leuconostoc suionicum、V. aphrogenes、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、葡萄球菌屬OJ82和木糖葡萄球菌。

結合KEGG Pathway中ko00330、ko00410和ko00480注釋的亞精胺和精胺代謝通路圖?？梢钥闯觯瑏喚返暮铣捎? 條途徑，第1條是腐胺在亞精胺合酶（EC: 2.5.1.16）的作用下生成亞精胺，涉及到的微生物有假交替單胞菌屬JB197和半透明假交替單胞菌；另外一條途徑是羧基亞精胺在羧基精胺脫羧酶（EC: 4.1.1.96）作用下生成亞精胺，產生這種酶的微生物是Vibrio sp.和V. aphrogenes；第3條途徑則是谷胱甘肽亞精胺在谷胱甘肽亞精胺酰胺酶（EC: 3.5.1.78）的作用下合成亞精胺，樣品中產生這種酶的微生物只有發(fā)光桿菌屬（Photobacterium sp.）NCIMB 13483。對于亞精胺的降解有2 條途徑，一條途徑是亞精胺在谷胱甘肽亞精胺合酶（EC: 6.3.1.8）作用下轉化為谷胱甘肽亞精胺，產生這種酶的微生物只有發(fā)光桿菌屬NCIMB 13483；另一條途徑則是在精胺合酶（EC: 2.5.1.22）作用下降解為精胺，樣品中產生這種酶的微生物只有硝化螺旋細菌（Nitrospirae bacterium）。

組胺可以通過組氨酸脫羧形成，同時可以通過基團轉移、酶氧化、化學合成等途徑被降解，樣品去宿主基因后，與KEGG數據庫進行比對，沒有注釋到代謝組胺的微生物，推測樣品中組胺的代謝可能是由于原料肉中內源酶的作用，導致樣品中檢測出低含量的組胺。

6 討論

本研究發(fā)現(xiàn)Vibrio sp.和V. aphrogenes兩種弧菌既能合成腐胺又能降解腐胺，同時還可以降解亞精胺；嗜冷桿菌屬YGAH215不僅降解色胺、苯乙胺和酪胺，還能合成腐胺；假交替單胞菌屬JB197不僅能降解尸胺和腐胺，同時能合成亞精胺；木糖葡萄球菌不僅能產生合成腐胺的酶，還可以產生降解腐胺的酶。

大部分研究人員認為，生物胺產生能力不能歸屬到分類種，只能歸屬到菌株。但本研究卻發(fā)現(xiàn)，熒光假單胞菌不參與酪胺和組胺的代謝，只與腐胺的合成有關；木糖葡萄球菌不參與組胺和酪胺的代謝，只與腐胺的代謝有關；腸球菌屬、乳桿菌屬和乳球菌屬不代謝組胺。已有報道和本研究結果不一致，可能是由于生物胺的形成應該歸屬于細菌菌株而不是微生物的分類種或者屬。

7 結論

研究發(fā)現(xiàn)羊肉香腸中微生物多樣性豐富，葡萄球菌屬、弧菌屬、酒球菌屬和嗜血桿菌屬是主要優(yōu)勢細菌屬；檢測出8 種生物胺，其中精胺含量最高。相關性分析表明尸胺與明串珠菌屬和假交替單胞菌屬等5 種細菌屬呈極顯著正相關；精胺與酒球菌屬和芽孢桿菌屬等15 種細菌屬呈顯著負相關；亞精胺與酒球菌屬和弓形菌屬等4 種菌屬呈顯著負相關；酪胺與酒球菌屬和泛菌屬等5 種菌屬呈顯著負相關，而與假交替單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬呈顯著正相關；色胺與葡萄球菌屬和鏈球菌屬呈顯著正相關；不存在與組胺、腐胺和苯乙胺顯著相關的細菌屬。經過eggNOG、KEGG數據庫比對，分別注釋到36 935、39 319 個基因，主要為碳水化合物代謝和氨基酸代謝。經KEGG數據庫注釋后，發(fā)現(xiàn)有代謝尸胺、腐胺、精胺和亞精胺的細菌和酶，有降解色胺、苯乙胺和酪胺的細菌和酶，沒有代謝組胺的細菌和酶，色胺、苯乙胺、酪胺和組胺的合成可能由于內源酶的作用。

相關鏈接：梭狀芽孢桿菌，分枝桿菌，嗜血桿菌屬，李斯特菌，明串珠菌，苯乙胺，偉業(yè)計量

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