千年草提取物對(duì)人成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響及其抗衰老作用（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-04-01 23:27 編輯者：夏德婷

目的探究千年草提取物的抗氧化活性及對(duì)人成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的影響及其抗衰老作用。方法分別采用熱水和乙醇提取千年草的籽、皮和莖，獲得提取物凍干粉末。檢測(cè)千年草的籽、皮和莖的熱水提取物、乙醇提取物的1,1二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)清除活性、2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)清除活性。采用千年草提取物與人皮膚成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，采用2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFHDA)熒光探針試劑盒檢測(cè)千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)清除活性，檢測(cè)千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的增殖作用及對(duì)Ⅰ型膠原蛋白合成的影響。結(jié)果千年草籽、皮、莖的熱水提取物和乙醇提取物均具有DPPH、ABTS和細(xì)胞內(nèi)ROS清除活性，隨著濃度增加，清除率升高，千年草籽乙醇提取物的DPPH和ABTS清除能力最強(qiáng)，其IC50分別為(47.96±5.18)μg/ml、(33.48±3.25)μg/ml。10μg/ml以上濃度的千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖均有一定的促進(jìn)作用，千年草籽的乙醇提取物和熱水提取物的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

千年草提取物對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的合成具有促進(jìn)作用，隨濃度增加促進(jìn)作用增強(qiáng)，其中，濃度為50μg/ml的千年草籽熱水提取物促進(jìn)作用越強(qiáng)。結(jié)論千年草熱水提取物和乙醇提取物均具有抗氧化活性、促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的合成作用，其中千年草籽的活性最強(qiáng)，能促進(jìn)細(xì)胞增殖，無(wú)明顯細(xì)胞毒性。

千年草是生長(zhǎng)在韓國(guó)濟(jì)州島、牙山等地的一種仙人掌，被稱為"手巴掌仙人掌",是一種可食用仙人掌。該品種個(gè)頭矮小，果實(shí)為紅色，具有很強(qiáng)的抗寒能力，能耐受-5℃的酷寒。其果肉富含多種蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等，營(yíng)養(yǎng)豐富，仙人掌還具有抑菌、消炎、增強(qiáng)免疫力、降血糖、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、促進(jìn)血液循環(huán)等多種藥用價(jià)值，臨床廣泛用于治療消化不良、胃痛、痢疾、痔血、咳嗽、糖尿病等多種疾病。除了食用價(jià)值和藥用價(jià)值，研究報(bào)道仙人掌果實(shí)具有抗氧化性，能加速創(chuàng)口愈合，抗衰老，增加皮膚的柔軟度，補(bǔ)充皮膚水分防止皮膚干燥，是保養(yǎng)皮膚的佳品。本研究分別通過(guò)熱水和乙醇提取千年草的皮、莖和籽，探究各種千年草仙人掌提取物體外抗氧化作用，及細(xì)胞內(nèi)清除活性氧(ROS)作用，對(duì)細(xì)胞的增殖作用，對(duì)膠原蛋白合成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

千年草仙人掌、1,1二苯基-2三硝基苯肼(DPPH)、偶氮二異丁脒鹽酸鹽(AAPH)購(gòu)自Sigma 公司；人皮膚成纖維細(xì)胞系 HSAS1購(gòu)自繼和生物科技，其余化學(xué)試劑均為分析純。電子天平購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-5299(2L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鞏義市瑞力儀器有限公司；紫外光分光度計(jì)上海棱光技術(shù)有限公司；艾本德 5810R臺(tái)式高速離心機(jī)；超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 提取工藝

千年草分為籽、皮和莖三部分，經(jīng)統(tǒng)一干燥，粉碎，過(guò)60目篩，得到對(duì)應(yīng)的千年草仙人掌籽、皮、莖粉末。水提液：分別稱千年草仙人掌籽、皮、莖粉末各10 g, 分別加入250 ml 65℃熱水，60℃水浴、200W超聲功率浸泡提取1 h, 抽慮，重復(fù)上述步驟3次，合并濾液，以3 000 r/min離心10 min, 取上清液備用。乙醇提液∶分別稱千年草仙人掌籽、皮、莖粉末各10 g, 分別加入250 ml 60%乙醇，60℃水浴、200 W超聲功率浸泡提取1 h, 抽慮，重復(fù)上述步驟3次，合并濾液，以3 000 r/min離心10 min, 取上清液備用。水提液和乙醇提液分別在60℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)為10 ml, 經(jīng)冷凍干燥分別得到籽、皮和莖的干燥粉末。

1.3 DPPH清除活性

在96孔板中依次加入不同濃度的千年草熱水提物和乙醇提物100 μl和DPPH溶液，避光放置孵育30 min后，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A1)。以等體積蒸餾水替代DPPH溶液，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度值A(chǔ)2。以等體積的95%乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度(A3)。以Vit C(VC)為陽(yáng)性對(duì)照，DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%,計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.4 2,2聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)清除活性

在96孔板中依次加入不同濃度的千年草水提物和醇提物250 μl和ABTS溶液50 μl, 避光放置孵育6 min后，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A3)。以等體積蒸餾水替代ABTS溶液，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度值A(chǔ)4。以等體積的95%乙醇代替樣品溶液作為空白對(duì)照，按上述步驟操作，測(cè)定吸光度(A5)。以VC為陽(yáng)性對(duì)照，ABTS自由基清除率(%)=[1-(A3-A4)/A5]×100%,計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.5 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇后的人皮膚成纖維細(xì)胞置于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。

1.6 千年草提取物細(xì)胞內(nèi)

ROS清除活性將傳代培養(yǎng)至第48代的人皮膚成纖維細(xì)胞配制成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，于96孔培養(yǎng)板接種，培養(yǎng)24 h 后分別使用不同濃度的偶氮二異丁脹鹽酸鹽(AAPH)溶液處理2、4、6、8 h, 采用2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯 (DCFHDA)試劑盒測(cè)定 ROS活性氧清除能力，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，確定AAPH最佳造模濃度和處理時(shí)間。以最佳的AAPH濃度和造模時(shí)間為模型，37℃5%CO2培養(yǎng)，在細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的熱水提物和乙醇提物培養(yǎng)1 h(對(duì)照組加入等體積血清)后，加入最佳AAPH造模濃度進(jìn)行最佳處理時(shí)間處理，處理完畢后，除去AAPH,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，再加入新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至16 h, 使用2 μl DCFHDA熒光探針試劑盒進(jìn)行ROS活性氧清除能力檢測(cè)，使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)拍照，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm, 發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。

1.7 千年草提取物的細(xì)胞增殖作用

配置1.6中細(xì)胞懸浮液于96孔培養(yǎng)板接種，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24 h后分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的水提物和醇提物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，對(duì)照組加入等體積空白血清，37℃ 5%CO2培養(yǎng)72 h, 用PBS沖洗，再加入2 mg/ml的噻唑藍(lán)(MTT)溶液30 μl, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 除去上清液，加入150 μl DMSO,充分震蕩，于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，與空白對(duì)照比較，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.8 千年草提取物對(duì)膠原蛋白合成的影響

將2 ml培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的人皮膚成纖維細(xì)胞以3×105個(gè)/ml濃度植入帶有蓋玻片的培養(yǎng)版中，蓋玻片在培養(yǎng)前經(jīng)多聚賴氨酸處理，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，分別加入1、10、50、100 μg/ml濃度的千年草熱水提物和乙醇提物，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣，對(duì)照組加入等體積血清，培養(yǎng)7 d后，使用 PBS緩沖液清洗蓋玻片，然后用5%丙酮固定，使用H2O2去除過(guò)氧化物酶，加入一抗，37℃下孵育2 h, 加入二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，采用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，中性樹(shù)膠封固。使用光學(xué)顯微鏡觀察，以棕黃色為陽(yáng)性，每張蓋玻片隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行觀察，通過(guò)LEICAQ軟件進(jìn)行灰度分析，觀察Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)，灰度值越低表示Ⅰ型膠原蛋白含量越高。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 DPPH、ABTS清除活性

千年草籽、皮、莖的熱水提取物和乙醇提取物的DPPH、ABTS清除率均隨著濃度的增加而升高(P<0.05)。千年草提取物的DPPH、ABTS清除率均明顯低于同等濃度的陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。千年草各部分提取物的DPPHIC50、 ABTS IC50值均明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組(均P<0.05),千年草各部分提取物中，千年草籽乙醇提取物的DPPH、ABTS清除能力最強(qiáng)，見(jiàn)表3。