研究HPLC同步測(cè)定禿瘡花中紫堇丁堿同分異構(gòu)體含量的方法。采用工業(yè)乙醇超聲輔助法提取禿瘡花全草干粉制得乙醇提取物,用等量石油醚和氯仿溶劑依次萃取,氯仿相采用柱層析法同步分離得到紫堇丁堿同分異構(gòu)體,采用HPLC測(cè)定其含量。

色譜條件:采用HPLC (E2695 Waters, 1525-2707 TCM-2489)、柱型C18 (250 mm×4.6mm, 5μm),甲醇(A)-水(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫(0～5 min, 10%A; 5～35 min, 10%A→100%A; 45～48 min, 100%A→10%A, 48～50 min, 10%A),上樣量1 mL,進(jìn)樣體積10μL,每個(gè)樣品運(yùn)行檢測(cè)時(shí)間50 min;柱溫30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)260nm。結(jié)果表明,禿瘡花中紫堇丁堿含量為0.79%,異紫堇丁堿含量為1.33%。紫堇丁堿和異紫堇丁堿是禿瘡花酸化氯仿相的主要活性成分,其同步富集工藝及HPLC同時(shí)檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道,試驗(yàn)為定量測(cè)定藥食同源植物中單體化合物的含量奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

禿瘡花[Dicranostigma leptopodum(maxim.)Fedde,DLF]，又名滇川禿瘡花、禿子花、紅茂草、勒馬回（陜西），屬于罌粟科禿瘡花屬。帶根全草民間供藥用，春夏采集，曬干；性涼，苦澀味，有毒；有清熱解毒、消腫止痛、殺蟲(chóng)的功效；用于治療扁桃體炎、牙痛、咽喉痛、淋巴結(jié)核，主治咽喉痛、扁桃體炎、齒齦腫痛、禿瘡、瘰疬、癤瘡、尋常疣、疥癬、癰疽、頭癬、體癬等。

現(xiàn)代藥理研究證明，傳統(tǒng)中草藥禿瘡花提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、殺蟲(chóng)等多種藥理活性]。禿瘡花化學(xué)成分主要為多種異喹啉類生物堿。其中，生物堿包括阿樸啡型、原小檗堿型、原阿片堿型，對(duì)癌細(xì)胞系如SMCC-7721、A549、HT-29、KB和p388等癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，可抑制癌細(xì)胞增殖，可能是禿瘡花抗腫瘤活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

工藝研究指出異紫堇丁堿在該植物中的含量較高[7]，并且具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。然而有關(guān)同步提取分離和HPLC同步測(cè)定紫堇丁堿同分異構(gòu)體的方法未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。試驗(yàn)采用超聲提取法和硅膠柱層析法分離純化紫堇丁堿和異紫堇丁堿，通過(guò)HPLC同時(shí)測(cè)定其含量，以期為禿瘡花的有效利用和資源開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

禿瘡花為花期全草，2018年5月采自陜西省西北農(nóng)林科技大學(xué)北校園區(qū)。經(jīng)過(guò)西北農(nóng)林科技大學(xué)苗芳教授鑒定為禿瘡花（Dicranostigma leptopodum(Maxim.)Fedde）。自然風(fēng)干，粉碎后用孔徑0.150 mm篩篩分，密封，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試驗(yàn)試劑

甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、石油醚、氨水、氫氧化鈉等（分析純，天津市津東天正精細(xì)化化學(xué)試劑廠，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；48～74μm氧化鋁、GF254薄層層析硅膠、74～149μm和48～74μm柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；0.5%CMC、110℃活化GF254薄層層析硅膠（自制）；羧甲基纖維素鈉（CMC）（南京化學(xué)試劑公司）；75%乙醇、95%工業(yè)乙醇（山東安捷高科公司）；色譜純甲醇（德國(guó)默克）；超純水（上海和泰）。

1.3 主要試驗(yàn)儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JPCT-20L型超聲提取器（無(wú)錫久平儀器有限公司）；WFH-203三用紫外分析儀（上海光譜儀器有限公司）；BC-R206型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司）；DZF-6051型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HPLC(Waters公司）；C-18反相色譜柱（Merk公司）；CP224C萬(wàn)分位電子分析天平（奧豪斯儀器常州有限公司）；YP30002電子天平（上海越平科學(xué)儀器蘇州制造有限公司）。

E2695 Waters高效液相色譜儀；1525-2707 TCM-2489色譜系統(tǒng)（Water 1525 Binary HPLC Pump,Water2707 Autosampler,Water 2489 UV/Visible Detector）；柱型C18(250 mm×4.6 mm,5μm),Breeze電腦程序系統(tǒng)。

1.4 提取分離試驗(yàn)方法

將禿瘡花全草藥材干燥粉碎，取其干粉400 g，用2 000 m L體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，在常壓下按照1︰5(g/m L）的固液比超聲波提取3次，45℃，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液，50℃減壓回收溶劑，制得乙醇提取物用水充分混懸后，依次用極性由小到大的不同溶劑萃取。用等量石油醚溶劑連續(xù)萃取3次，混合萃取液，并減壓蒸餾除去石油醚溶劑，得石油醚萃取相浸膏，剩余水相，加入鹽酸進(jìn)行酸化（p H 1～2），用等量氯仿溶劑萃取3次，合并萃取液，減壓除去氯仿溶劑，得酸化氯仿相。取1.00 g禿瘡花酸化氯仿相，用48～74μm硅膠柱層析和中性Al2O3柱層析（規(guī)格：35 mm×280 mm），洗脫劑依次為V(CHCl3）︰V(CH3OH)=15︰1～8︰1，分離得到196.9 mg紫堇丁堿和488.6 mg異紫堇丁堿[8]。紫堇丁堿占酸化氯仿相的19.7%，異紫堇丁堿占酸化氯仿相的48.9%，兩者合計(jì)共占酸化氯仿相的68.6%，是酸化氯仿相的主要有效成分。

2 含量測(cè)定

2.1 供試樣品及濃度配制

實(shí)時(shí)提取物：稱取5 g禿瘡花全草粉末，用95%工業(yè)乙醇，于50℃超聲提取，提取3次，每次1 h，制得0.855 g醇提物，命名為TCH-1。

禿瘡花中生物堿類化合物紫堇丁堿（Cor）、異紫堇丁堿（Iso-Cor）均為研究分離、提取和純化的單體化合物。

稱取相應(yīng)量的醇提物和單體化合物，用色譜甲醇溶解，并用0.22μm超濾膜過(guò)濾，配制成相應(yīng)濃度的甲醇溶液。生物堿單體化合物濃度和醇提物濃度配制梯度見(jiàn)表1和表2所示。

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