2.8 10批樣品含量測定

分別取10批樣品(批號：20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721、20160724)按供試液法每批次各平行制備2份供試液，按色譜條件自動進(jìn)樣測定，其對照液白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(濃度71.76 μg/mL)分別進(jìn)樣30、20、10 μL，且每個進(jìn)樣量分別進(jìn)樣2次；每份供試液各進(jìn)樣2針，記錄色譜圖和峰面積，并計算含量以及RSD值(表7)，計算得馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ不同進(jìn)樣量含量分別為2.15、2.58、2.54，平均含量為2.43 μg/mL，相對含量RSD=9.82%。考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中的各種損失和測量誤差，取其平均值的80%作為其含量限度，即2.43×0.80=1.94，故暫定馬香苓口服液中白術(shù)藥材按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計不少于1.94 μg/mL。

3 討論

3.1 待測組分選擇

白術(shù)的內(nèi)酯類成分具有抗炎、增強(qiáng)免疫、利尿等作用，而且還可以調(diào)理胃腸道和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ的藥理作用較為明顯，也是發(fā)揮白術(shù)健脾益氣、燥濕利水的功效之一。在炮制過程中蒼術(shù)酮被氧化，其產(chǎn)物是雙白術(shù)內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，同時白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在經(jīng)高溫加熱過程中會生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；從氧化反應(yīng)機(jī)制來看，蒼術(shù)酮易與水發(fā)生加成反應(yīng)，生成半縮醛羥基，而水又導(dǎo)致半縮醛羥基開環(huán)生成羰基，羰基進(jìn)一步被氧化生成羧基，雜化軌道平面兩側(cè)容易被羥基進(jìn)攻羧基，羥基并與羧基進(jìn)行分子內(nèi)脫水反應(yīng)，可生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和表白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，而白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在7位上與碳相連的氫相比較為活躍，易被羥基取代而生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的結(jié)構(gòu)較其穩(wěn)定，更有利于含量測定。

3.2 供試液前處理

按照萃取溶劑的方法，考察了正丁醇、石油醚(30℃～60℃)、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)品色譜法相比較，石油醚(60℃～90℃)所萃取得到的供試液峰形較好，分離度高，但其前面有一小雜峰，后改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作為復(fù)級溶液，考慮到白術(shù)內(nèi)酯類成分的穩(wěn)定性，并同時選擇了考察柱溫的最佳條件(20℃、30℃、35℃)，結(jié)果表明，在柱溫為25℃、選用500 mL/L甲醇水溶液作為復(fù)級溶液，所出的峰形分離度高，峰形對稱且含量較高。有關(guān)提取次數(shù)優(yōu)選，在其他相同條件下，用石油醚(60℃～90℃)振搖提取3～5次，結(jié)果表明，用供試品提取3次與4、5次有較大差異，而4、5次時白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量無明顯差異，故選擇用石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次。

3.3 色譜條件選擇

本制劑通過單因素試驗(yàn)，對其柱子型號、柱溫、流速、流動相比例進(jìn)行優(yōu)化和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以及波長的選擇，用紫外分光光度計測量白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的最大吸收波長，結(jié)果在223 nm處吸收峰最強(qiáng)；在流動相選擇上參考其他學(xué)者研究，用標(biāo)準(zhǔn)品白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ進(jìn)行判定等度條件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情況，試驗(yàn)表明用甲醇-水(60∶40)對其標(biāo)準(zhǔn)品的峰更好，含量更高，同樣條件下進(jìn)樣測定供試液，發(fā)現(xiàn)其分離度達(dá)不到《中國獸藥典》的要求，雜峰較多，故進(jìn)行了梯度洗脫，考慮中藥成分復(fù)雜多樣，會影響色譜柱的質(zhì)量以及下一針進(jìn)樣的出峰情況，故在樣品目標(biāo)峰等完全出完過后使用了純甲醇進(jìn)行沖洗色譜柱10 min， 然后用15 min再平衡到流動相的初始比例以方便下一針進(jìn)樣分析，最終確定了流動相條件。在其他條件不變情況下，柱溫的改變對其供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.15%，且柱溫過高，易導(dǎo)致峰形不對稱，有拖尾現(xiàn)象，綜合考慮，最終選用柱溫為25℃；在柱溫25℃等其他條件不變情況下，改變流速0.8 mL/min±0.2 mL/min， 發(fā)現(xiàn)供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.49%，說明改變流速對樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測定無影響，對其樣品出峰時間早晚有一定影響，但對峰的對稱性、分離度無影響，故最終確定流速為0.8 mL/min。

試驗(yàn)證明以流動相甲醇-水(體積比)進(jìn)行梯度洗脫(甲醇60→65、水40→35運(yùn)行30 min， 甲醇65→100、水35→0運(yùn)行2 min， 甲醇100、水0運(yùn)行10 min， 甲醇100→60、水0→4運(yùn)行3 min， 甲醇60、水40運(yùn)行15 min)、檢測波長223 nm、柱溫25℃、流速0.8 mL/min的色譜條件對白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測定具有較強(qiáng)的專屬性，能達(dá)到基線平衡、與其他組分離度較高、峰形對稱、陰性對照無干擾、大大縮短分析時間，便于作為含量測定和方法學(xué)研究。

建立的HPLC方法測定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的平均峰面積RSD分別為2.00%、6.00%和8.58%；平均加樣回收率為98.04%，RSD=11.89%，其回收率相對良好，進(jìn)行10批樣品的含量測定，暫定馬香苓口服液中白術(shù)藥材按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計不少于1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征圖譜專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可行、簡便，可快速用于鑒別馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ以及其含量，可有效地用于該制劑的質(zhì)量控制，同時該方法還可以為進(jìn)一步加強(qiáng)含白術(shù)類化合物的制劑質(zhì)量控制提供參考，為申報新獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

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