靈芝是一種寶貴的藥用真菌，其中以赤芝（又名紅芝）和紫芝的藥理價(jià)值最高，被視為珍貴的中藥材?；瘜W(xué)成分研究表明多糖和三萜類化合物為主要的藥效成分，其中靈芝三萜有強(qiáng)烈的藥理活性，可以起到抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抑制疼痛、抑制組織胺釋放等作用。

靈芝三萜化合物提取和純化方法很多，提取方法有超聲波輔助法、回流提取法、微波法、超臨界CO2提取法，純化方法有吸附色譜法、高效液相色譜法、薄層色譜法，其中回流提取法操作簡單、提取效率高，適合中小企業(yè)生產(chǎn)在線監(jiān)測。試驗(yàn)所用材料靈芝發(fā)酵粉是以谷物為基質(zhì)經(jīng)靈芝固態(tài)發(fā)酵后精制而成，基質(zhì)中淀粉等物質(zhì)可能會(huì)對產(chǎn)品中三萜化合物的形成及三萜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響提取工藝，研究結(jié)果會(huì)為后期功效分析奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、材料

靈芝發(fā)酵粉：以谷物為基質(zhì)，經(jīng)靈芝固態(tài)發(fā)酵后精制而成，由山西瑞芝生物科技有限公司提供。

2、儀器與試劑

DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海恒科學(xué)儀器有限公司；UV754N紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL6M低速離心機(jī)：上海百典儀器設(shè)備有限公司；KQ-300GDV數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FW100微型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；BS-100A自動(dòng)部份收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；LC1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；TENSOR27傅立葉紅外光譜儀：德國布魯克公司；Cary5000紫外-可見-近紅外分光光度計(jì)：美國安捷倫公司；UV-A紫外分析儀：上海嘉鵬科技有限公司。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品：安徽酷耳生物工程有限公司。200～300目柱層析硅膠：青島海洋化工廠生產(chǎn)；薄層層析硅膠板：煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司。

3、方法

（1）靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的提取與測定

參照陳飛的方法，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，于555nm處測定吸光度，制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=57.516x-0.0114，R²=0.9993。

稱取2g靈芝發(fā)酵粉，加入適量一定濃度的乙醇浸泡一段時(shí)間后，在一定溫度下進(jìn)行回流處理?；亓骱笕〕龇爬?，在20℃下以4000r/min離心10min，合并上清液。將上清液減壓濃縮至5mL，用移液管吸取1mL到試管中，分別加入0.3mL5%香草醛-冰醋酸溶液和1mL高氯酸，70℃水浴25min，冷水浴中冷卻，加入10mL冰乙酸，搖勻后測定。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面BoxBehnken對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表見表1。

（2）靈芝三萜粗提物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定

①靈芝三萜粗提物的分離純化

將靈芝三萜粗提物經(jīng)減壓濃縮后進(jìn)行硅膠柱層析分離純化。第一次洗脫采用的洗脫劑為CHCl₃∶CH₃OH=90∶10，流速0.5mol/mL，每管2mL分部收集，薄層層析定性分析，選擇展開呈現(xiàn)相同斑點(diǎn)流分收集，將分離的流分進(jìn)行二次洗脫分離。二次洗脫的洗脫劑為CHCl₃∶CH₃OH=20∶1，流速0.5mol/mL，每管3mL分部收集，逐管測定三萜含量。

②靈芝三萜化合物的HPLC純度鑒定

采用色譜柱：Agllent5TC-C18（2）250×4.6mm；柱溫為室溫；流動(dòng)相為2%乙酸溶液-乙睛（70∶30）；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20µL；檢測波長254nm。

③紫外光譜掃描

將靈芝酸溶于甲醇，以甲醇為空白試劑在190～370nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

④紅外光譜分析

以KBr壓片法進(jìn)行紅外光譜分析。

4、數(shù)據(jù)處理方法

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用DPS軟件進(jìn)行方差顯著性分析，Design-Expert軟件對響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次模擬回歸分析。

二、結(jié)果與分析

1、靈芝三萜的提取工藝優(yōu)化

（1）乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響

由圖1可知，采用不同濃度的乙醇對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物浸提得率有極顯著影響（p＜0.01）。乙醇濃度為95%時(shí)，三萜得率最高。當(dāng)乙醇濃度在95%以下時(shí)，三萜得率隨乙醇濃度的提高而提高，但當(dāng)乙醇濃度大于95%時(shí)，三萜的浸提得率反而會(huì)下降。因此，后續(xù)試驗(yàn)選擇95%乙醇進(jìn)行提取。

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