泡菜是浸泡于食鹽含量為2％～8％的鹵水中，依靠蔬菜自身攜帶乳酸菌厭氧發(fā)酵而成的一類發(fā)酵蔬菜制品的總稱，目前用于泡菜制作的蔬菜主要包括蘿卜、辣椒、白菜、青菜和豇豆等，其中酸豇豆因營養(yǎng)成分齊全、口感脆爽且風(fēng)味獨特而成為我國泡菜的重要組成部分。在泡菜發(fā)酵過程中，鹵水中微生物群系的變化直接決定了泡菜風(fēng)味品質(zhì)的形成，因而國內(nèi)外眾多學(xué)者對泡菜中微生物的多樣性開展了相對系統(tǒng)的研究，多數(shù)研究均證實Leuconostocmesenteroides，(腸膜明串珠菌)、Leuconostocmesentoroides(植物乳桿菌)和pediococcuspentosaceus(戊糖片球菌)為泡菜中的優(yōu)勢乳酸菌。

近年來隨著健康意識的提升，消費者越來越傾向于低鹽豇豆泡菜，而自然發(fā)酵的酸豇豆是最易發(fā)生軟腐、產(chǎn)生酸敗味和“生花”的泡菜之一。較之自然發(fā)酵，乳酸菌純種發(fā)酵的豇豆質(zhì)地變化快且成熟周期短，同時風(fēng)味較純正，因而在對酸豇豆中乳酸菌進(jìn)行分離鑒定的基礎(chǔ)上，積極開展具有優(yōu)良發(fā)酵特性乳酸菌菌株的篩選，進(jìn)而推動酸豇豆發(fā)酵模式的改變具有積極的意義。作為華中地區(qū)重要的“動植物基因庫”，恩施土家族苗族自治州位于鄂、湘和渝三省(市)交匯處，境內(nèi)森林覆蓋率近70％，居住著漢族、土家族、苗族和侗族等眾多少數(shù)民族。恩施土家族苗族自治州恩施市居民歷來有制作和食用酸豇豆的習(xí)俗，因而該地酸豇豆中亦可能蘊含著豐富的乳酸菌資源。

本研究對采集自恩施市酸豇豆中乳酸菌的多樣性進(jìn)行了解析，在對其蘊含的乳酸菌資源進(jìn)行分離鑒定和保藏的基礎(chǔ)上，使用電子鼻和電子舌技術(shù)對L.plantarum脅塒加純種發(fā)酵酸豇豆的品質(zhì)進(jìn)行了評價，以期為后續(xù)具有優(yōu)良酸豇豆發(fā)酵特性乳酸菌的篩選提供菌株支持。

一、材料與方法

1、材料與試劑

酸豇豆采集自恩施土家苗族自治州恩施市舞陽壩菜市場和土橋壩菜市場；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethylammoniumbromide，CTAB)、氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷、碳酸鈣、十二烷基硫酸鈉、甘油、過氧化氫、氯仿、飽和酚和異戊醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；10×PCRBuffer、rTaq酶和dNTPmix，北京全式金生物技術(shù)有限公司；正向引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1495R(5’-CTACGGCTACCTrGTTACGA-3’)，由武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司合成；AxygenPcR清潔試劑盒，康寧生命科學(xué)吳江有限公司。

2、儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站，英國DWS公司；ECLIPSECi生物顯微鏡，日本Nikon公司；ND-2000C微量紫外分光光度計，美國NanoDrop公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；UVPcDs8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Proteinsimple公司；vetiri梯度基因擴(kuò)增儀，美國AB公司；5810R臺式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；HwS24型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SA402B味覺分析系統(tǒng)，日本INSENT公司；PEN3型電子鼻，德國Airsense公司；BS224S電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PGJ-10-AS純水儀，武漢品冠儀器設(shè)備有限公司。

3、檢測與分析方法

（1）酸豇豆中潛在乳酸菌菌株的分離

采用倍比稀釋的方法對酸豇豆樣品中的菌群進(jìn)行稀釋，選取合適濃度的稀釋液涂布于含有1.0％碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基中，在氮氣、氫氣和二氧化碳體積比為85:10:5的厭氧工作站中37℃培養(yǎng)48h。選取形態(tài)大小不同且有透明圈的單菌落進(jìn)行分離并進(jìn)行3代純化，最終將過氧化氫酶實驗為陰性且革蘭氏染色為陽性的菌株定義為潛在乳酸菌菌株，并使用甘油保藏后置于-80℃冰箱備用。

（2）酸豇豆中潛在乳酸菌菌株的鑒定

將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測，上樣量為2.5μL。同時使用清潔試劑盒將擴(kuò)增產(chǎn)物清潔后，進(jìn)行克隆鑒定，并選取陽性克隆送往武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司進(jìn)行測序，反饋回的序列經(jīng)拼接后在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，依據(jù)序列同源性選取與相似度≥99％的模式菌株確定種屬關(guān)系，并使用MEGA7.O軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

（3）L.plantarum純種發(fā)酵酸豇豆的制作

將豇豆洗凈瀝干后切成長約5cm的小段放入2L玻璃泡菜壇中，同時按照每250g豇豆添加35.5g食鹽和600mL純凈水的比例進(jìn)行酸豇豆的制備。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測，上樣量為2.5μL。攪拌均勻后泡菜壇口水封，置培養(yǎng)箱中中30℃發(fā)酵7d。同時以未接入乳酸菌的酸豇豆作為對照組，且將其定義為自然發(fā)酵組。

（4）L.plantarum純種發(fā)酵酸豇豆品質(zhì)的評價

將豇豆洗凈瀝干后切成長約5cm的小段放入2L玻璃泡菜壇中，同時按照每250g豇豆添加35.5g食鹽和600mL純凈水的比例進(jìn)行酸豇豆的制備。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測，上樣量為2.5μL。攪拌均勻后泡菜壇口水封，置培養(yǎng)箱中中30℃發(fā)酵7d。發(fā)酵好的酸豇豆?jié){水300r/min離心10min取上清，使用SA402B電子舌參照王玉榮的方法進(jìn)行酸、苦、澀、咸和鮮5個基本味及后味-A、后味-B和豐度3個回味指標(biāo)相對強(qiáng)度的測定，進(jìn)而評價L.plantarum純種發(fā)酵對酸豇豆滋味品質(zhì)的影響。

亦取豇豆洗凈瀝干后切成長約5cm的小段放入2L玻璃泡菜壇中，同時按照每250g豇豆添加35.5g食鹽和600mL純凈水的比例進(jìn)行酸豇豆的制備。按照5×10⁶/g豇豆的比例接入將潛在乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后3000r/min離心10min收集菌體，使用CTAB法進(jìn)行基因組DNA提取，并以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：2.5μL10×PCRBuffer，2μLdNTP，正向和反向引物各0.5μL，0.2μLrTaq酶，1μLDNA模板和18.3μL無菌水。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；95℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)30次；72℃10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后使用1.0％瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增效果進(jìn)行檢測，上樣量為2.5μL。攪拌均勻后泡菜壇口水封，置培養(yǎng)箱中中30℃發(fā)酵7d。發(fā)酵好的酸豇豆?jié){水直接裝入15mL樣品瓶中，55℃水浴10min后室溫平衡20min，參照楊成聰?shù)姆椒ㄊ褂肞EN3電子鼻10組金屬氧化物傳感器對各敏感物質(zhì)的響應(yīng)值進(jìn)行檢測，進(jìn)而評價L.plantarum純種發(fā)酵對酸豇豆風(fēng)味品質(zhì)的影響。

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