目的：建立HPLC法同時(shí)測(cè)定引陽(yáng)索中五味子醇甲、五味子乙素的含量。方法：采用AgilentExtendC18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，流速為1.1mL·min^-1；梯度洗脫；進(jìn)樣量為10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm；柱溫為32℃。結(jié)果：五味子醇甲、五味子乙素的線性范圍分別為7.013～175.3mg·L^-1(r=0.9998，n=7)和7.040-176.0mg·L^-1(r=0.9998，n=7)；提取回收率：五味子醇甲96.05%(RSD=0.7%，n=6)，五味子乙素96.48%(RSD=0.9%，n=6)。結(jié)論：本法操作專屬性強(qiáng)、快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于引陽(yáng)索的質(zhì)量控制。
引陽(yáng)索收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第三冊(cè)，由淫羊藿浸膏與五味子浸膏按2∶1混合制成顆粒劑，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)，生津功能，用于陽(yáng)痿早泄，腰膝酸軟，津虧自汗，頭暈?zāi)垦５劝Y?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中缺少對(duì)處方中五味子浸膏質(zhì)量控制的方法，譚文明和孟淑智先后報(bào)道了引陽(yáng)索中五味子浸膏指標(biāo)成分五味子甲素和五味子醇甲的TLC鑒別方法，目前尚未有引陽(yáng)索中五味子浸膏指標(biāo)成分五味子醇甲和五味子乙素含量測(cè)定的報(bào)道，本文建立了同時(shí)測(cè)定引陽(yáng)索中五味子醇甲和五味子乙素的含量方法，本研究專屬性強(qiáng)，可用于引陽(yáng)索中五味子浸膏的質(zhì)量控制。

1儀器

Waters2695高效液相色譜儀(包括工作站、自動(dòng)進(jìn)樣、柱溫箱、2998型二極管陣列檢測(cè)器美國(guó)Waters公司)，XPE205電子天平(METTLERTOLEDO公司)，超聲波清洗機(jī)(HT300功率：40KHZ濟(jì)寧恒通超聲電子設(shè)備)，超純水機(jī)(Milli-QAdvantageA10默克密理博公司)。

2材料

五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào)110857-201010含量99.4%)、五味子甲素對(duì)照品(批號(hào)110764-201010含量99.6%)、五味子乙素對(duì)照品(批號(hào)110765-200710)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，引陽(yáng)索藥品3批(批號(hào)：20170704，20180604，20191103，市售)，淫羊藿(批號(hào)：1910001，安國(guó)市聚藥堂藥業(yè)有限公司)，超純水(自制)，其他試劑(色譜純，市售)。

3方法和結(jié)果

3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：AgilentExtendC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%磷酸溶液(C)，梯度洗脫：0～24min為35%～55%A，30%～30%B；24～27min為55%～35%A，30%～30%B；27～30min為35%～35%A，30%～30%B；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1.1mL·min^-1；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：32℃。五味子醇甲、五味子乙素與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于5000。

3.2溶液的制備

3.2.1對(duì)照儲(chǔ)備液

取P2O5干燥13h的五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品，分別精密稱取14.11mg、16.62mg、14.08mg置20mL量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(五味子醇甲701.3mg·L^-1，五味子甲素827.7mg·L^-1，五味子乙素704.0mg·L^-1)。分別精密量取1mL，置同一10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液。

3.2.2供試品溶液

取供試品5袋，精密稱重，研細(xì)，精密稱取5g(相當(dāng)于1袋)，置100mL具塞錐形瓶中，加體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液50mL，密塞，稱重，超聲提取30min；放置至室溫，稱定重量，用上述甲醇溶液補(bǔ)足減失重量，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，備用。

3.2.3陰性對(duì)照溶液
按引陽(yáng)索處方，不加五味子浸膏，按“3.2.2”條方法制備陰性對(duì)照溶液。按“3.1”條色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖見(jiàn)圖1。

3.3線性關(guān)系考察

依次精密量取五味子醇甲、五味子乙素對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分別置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得不同濃度系列混合對(duì)照溶液。按“3.1”條色譜條件，進(jìn)樣10μL，以峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度X(mg·L^-1)進(jìn)行回歸分析，得：五味子醇甲回歸方程Y=2.062×104X-7.829×104(r=0.9998，n=7)，在7.013～175.3mg·L-1內(nèi)，五味子醇甲線性良好；五味子乙素回歸方程Y=1.543×104X-6.039×104(r=0.9998，n=7)，在7.040～176.0mg·L-1內(nèi)，五味子乙素線性良好。

3.4精密度試驗(yàn)

取五味子醇甲、五味子乙素混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，按“3.1”條色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10μL，測(cè)得五味子醇甲峰面積分別為1386130、1413230、1416601、1409903、1398858，RSD為0.9%(n=5)；五味子乙素峰面積分別為1039735、1068231、1064348、1059376、1053065，RSD為1.1%(n=5)，結(jié)果表明儀器有良好的精密度。

3.5穩(wěn)定性試驗(yàn)

取引陽(yáng)索顆粒適量，按“3.2.2”條方法制備供試溶液，依次在0、2、6、10、18、24、48h，重復(fù)進(jìn)樣，每次10μL，測(cè)得五味子醇甲峰面積分別為1439032、1428035、1419366、1418367、1421035、1416534、1403982，RSD為0.8%(n=7)；五味子乙素峰面積分別為505762、504927、506354、498756、492769、503262、491965，RSD為1.2%(n=7)，結(jié)果表明樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6重復(fù)性試驗(yàn)

分別精密稱取同一批引陽(yáng)索(批號(hào)20180604)5份，按“3.2.2”條方法制備供試溶液，測(cè)量五味子醇甲含量分別為3.63、3.68、3.67、3.69、3.64mg/袋，RSD為0.7%(n=5)，五味子乙素含量分別為1.82、1.81、1.79、1.83、1.84mg/袋，RSD為1.0%(n=5)，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

3.7回收率試驗(yàn)

分別精密稱取已知含量的引陽(yáng)索(批號(hào)20180604)約2.5g，6份，分別置100mL錐形瓶中，分別精密加入對(duì)照溶液：五味子醇甲對(duì)照溶液(0.9165mg·mL^-1)、五味子乙素(0.9118mg·mL^-1)、各2.0、1.0mL，按“3.2.2”條方法制備供試溶液，進(jìn)樣10μL，結(jié)果測(cè)得五味子醇甲、五味子乙素平均回收率分別為96.05%(RSD=0.7%，n=6)、96.48%(RSD=0.9%，n=6)，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.8樣品含量測(cè)定
取引陽(yáng)索10袋，按“3.2.2”條方法制備供試溶液，平行3份。按“3.2.1”條方法制備對(duì)照品溶液，按“3.1”條色譜條件，進(jìn)樣10μL，用外標(biāo)法測(cè)定3批引陽(yáng)索樣品中五味子醇甲和五味子乙素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

4討論

4.1測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

宣東平等報(bào)道了五味子醇甲和五味子乙素同時(shí)檢測(cè)的波長(zhǎng)為254nm，《中國(guó)藥典》2015版五味子含量測(cè)定項(xiàng)下測(cè)定五味子醇甲的波長(zhǎng)為250nm，綜合考慮被測(cè)物質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)、吸收強(qiáng)度，最終選定250nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相比較了甲醇-0.1%磷酸溶液(35：65)、乙腈-0.1%磷酸溶液(30：70)，發(fā)現(xiàn)被測(cè)成分可以達(dá)到基線分離，但五味子乙素保留時(shí)間超過(guò)60min，與楊立志等研究結(jié)果相同，最終選擇甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液三元系統(tǒng)為流動(dòng)相，梯度洗脫，流動(dòng)相通過(guò)引入乙腈縮短被測(cè)物質(zhì)保留時(shí)間，線性調(diào)整甲醇和0.1%磷酸溶液比例使3種木脂素與其他物質(zhì)有效分離，結(jié)果樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素分離效果好，無(wú)雜質(zhì)干擾，且出峰快，保留時(shí)間分別為五味子醇甲5.18min、五味子甲素16.88min、五味子乙素20.35min。

4.3含量測(cè)定指標(biāo)選擇

任偉光等報(bào)道了五味子醇甲、甲素、乙素是五味子中重要木脂素類化合物，有保護(hù)肝臟、中樞抑制、降糖、抗炎等藥理作用。馬瑩慧等報(bào)道了五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素、乙素為指標(biāo)的含量分析方法，李寶等報(bào)道了五味子浸膏中五味子醇甲、甲素、乙素的含量測(cè)定方法，本研究發(fā)現(xiàn)引陽(yáng)索樣品色譜圖中五味子甲素色譜峰峰面積較小，因此本文僅選擇了五味子醇甲和五味子乙素2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。五味子甲素色譜峰可作為特征峰之一，用于引陽(yáng)索中五味子浸膏的定性鑒別。

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