轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的糖基化修飾對(duì)黑豆蛋白抗氧化活性的影響（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-02-25 19:22 編輯者：周世紅

黑豆因其種皮呈黑色而得名，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有高蛋白、低熱量的特性，其含有微量元素、維生素和大豆皂甙等多種功能因子，此外，黑豆還具有美容、防癌作用；殼寡糖是一種聚合度在2～20之間的寡糖，具有分子量低、吸附效果好，水溶性好、易被人體吸收、生物活性高，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、改善腸道組織形態(tài)和增強(qiáng)免疫功能等特點(diǎn)；蛋白質(zhì)的糖基化修飾，是以共價(jià)鍵連接的方式將親水性的糖類物質(zhì)導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子之中，使其既有蛋白質(zhì)的分子特性，又有糖類物質(zhì)的親水特性；研究表明，蛋白質(zhì)糖基化修飾后表現(xiàn)出優(yōu)越的乳化能力，其溶解性、膠凝性、流變學(xué)特性、抗氧化性、熱穩(wěn)定性、抗菌性等功能特性也有所提高。蛋白質(zhì)糖基化修飾后抗氧化性的研究較少；本文利用糖基化修飾技術(shù)，以殼寡糖和黑豆蛋白為研究對(duì)象，制備殼寡糖糖基化黑豆蛋白，探討其抗氧化性能的變化，為拓展糖基化蛋白改性和提供天然的抗氧化劑提供基本技術(shù)依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料和試劑

黑豆，黑龍江地產(chǎn)青仁黑豆。DPPH(分析純)，美國(guó)Sigam公司；ABTS(AR級(jí))，美國(guó)Sigam公司；水溶性維生素E(Trolox)，美國(guó)Sigam公司；殼寡糖，浙江金殼藥業(yè)有限公司；三氯化鐵(FeCl₃)(分析純)，天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；鐵氰化鉀(K₃Fe(CN)₄)(分析純)，天津光復(fù)精細(xì)化工研究院；三氯乙酸(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠，磷酸三鈉(Na₃PO₄)(分析純)，天津市長(zhǎng)鑫宏翔商貿(mào)有限公司；鉬酸銨(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉(分析純)，天津市鴻鑫化學(xué)試劑有限公司；對(duì)氨基苯磺酰胺(分析純)，天津光復(fù)精細(xì)化工研究院；鹽酸N-(1-萘基)-乙二胺(分析純)，天津光復(fù)精細(xì)化工研究院。

2、試驗(yàn)儀器

DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋購(gòu)白天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自瓦里安科技有限公司；XS204電子分析天平購(gòu)自上海精學(xué)科學(xué)有限公司；漩渦混合器購(gòu)自江蘇同君儀器科技有限公司。

3、方法

（1）溶液配制

①DPPH工作液配置：精確稱量0.0123gDPPH，乙醇充分溶解并定容至50mL，作為DPPH工作液(0.39mM)。

②PBS緩沖液：稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HP0₄和0.24gKH₂P0₄，溶于800mL蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.4，最后加蒸餾水定容至lL即可。高壓蒸汽滅菌20min，保存于室溫或4℃冰箱中。

③ABTS工作液配置：精確稱取0.192lgABTS標(biāo)準(zhǔn)品溶解于50mL蒸餾水中，制成7.0mol／L的ABTS水溶液。精確稱取0.3312g過硫酸鉀溶解于500mL蒸餾水中，制成2.45mmo/L過硫酸鉀水溶液。將50mLABTS水溶液與50mL過硫酸鉀水溶液混合，在室溫下避光放置12h～16h，形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取1.0mL加入40～50mL的無水乙醇，在734nm下吸光度為O.700±0.020得到ABTS工作液。

(2)黑豆蛋白的制備

①黑豆分離蛋白：黑豆蛋白分離提取的方法參照本研究前期試驗(yàn)中經(jīng)過優(yōu)化的提取方案：400g黑豆豆粕粉，加水4L，用0.5mol／LNaoH調(diào)pH至8.5，50℃水浴攪拌1.5h，8000r/min離心10min取上清液，用0.5mol／L鹽酸調(diào)pH至4.5，8000r/min離心10min取下層固體，用pH為4.5的蒸餾水洗兩遍，8000r/min離心10min，取沉淀，用0.5mol／LNaOH調(diào)pH至7.0，冷凍干燥(干燥條件：干燥架溫度-20℃，真空度0.5mbar)

②酶法糖基化黑豆蛋白：酶法糖基化黑豆蛋白的方法參照本實(shí)驗(yàn)前期試驗(yàn)中優(yōu)化所得方案：取1.5g黑豆分離蛋白，加1.5g殼寡糖，1.0g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和100mL蒸餾水，37℃水平振蕩反應(yīng)4h，80℃水浴滅酶5min，冷卻至室溫后4℃透析除去未結(jié)合的殼寡糖，冷凍干燥。

③自交聯(lián)黑豆蛋白：為對(duì)比不同改性方法下黑豆蛋白的抗氧化性，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的加入比例同②，取1.5g黑豆分離蛋白，加1.0g轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和100mL蒸餾水，37℃水平振蕩反應(yīng)4h，80℃水浴滅酶5min，冷卻至室溫后4℃透析除去未結(jié)合的殼寡糖，冷凍干燥。

④濕熱法糖基化黑豆蛋白：為對(duì)比不同改性方法下黑豆蛋白的抗氧化性，殼寡糖的加入比例同②，取1.5g黑豆分離蛋白，加1.5g殼寡糖和100mL蒸餾水，90℃水浴4h，取出在25℃水浴5min，4℃透析除去未結(jié)合的殼寡糖，冷凍干燥。

(3)DPPH自由基清除能力測(cè)定

本試驗(yàn)中DPPH自由基清除能力測(cè)定在參考Sajga等的方法基礎(chǔ)上，稍作改動(dòng)。吸取1mL待測(cè)液，加入2mLDPPH工作液充分搖勻，在室溫下避光30min，在517m處測(cè)定該液吸光度(Ai)，以無水乙醇作為空白，同時(shí)測(cè)定lmL試液與2mL無水乙醇的吸光度(Aj)及1mL無水乙醇和2mLDPPH工作液混合液的吸光度(Ac)，按下式計(jì)算DPPH的清除率(SA)。

（4）ABTS自由清除能力測(cè)定

參照唐艷平等的方法略作改動(dòng)。吸取1.0mL待測(cè)液加入1.0mL的ABTS工作液，混勻。在室溫下避光10min，于波長(zhǎng)734nm下測(cè)其吸光度(Ai)，無水乙醇作為空白，同時(shí)測(cè)定30μL試液和1.0mL無水乙醇混合液吸光度(Aj)及30μL無水乙醇和1.0mL的ABTS工作液混合液吸光度(Ac)，按下式計(jì)算ABTS自由基清除率(SA)。

（5）總還原能力的測(cè)定

本試驗(yàn)中樣品總還原能力的測(cè)定在Oyaizu等的方法基礎(chǔ)上稍作調(diào)整。取測(cè)試樣品溶液0.5mL加入pH為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1％的K₃Fe(CN)₆溶液各2.5mL并混合均勻，于50℃放置20min，加入2.5mL蒸餾水和1.0mL0.1％的FeCl₃混合均勻，靜止10min后于700nm下測(cè)定吸光度(用0.5mL的蒸餾水替換0.5mL樣品溶液其他條件不變作為調(diào)零溶液)。

（6）總抗氧化能力的測(cè)定

本試驗(yàn)中總抗氧化能力的測(cè)定參照Benzuie和Strain的方法，略做改進(jìn)。使用磷鉬絡(luò)合物法，又稱鉬藍(lán)法。總抗氧化能力測(cè)定原理：鉬酸銨會(huì)在硫酸與磷酸的作用下發(fā)生還原反應(yīng)，產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色，該物質(zhì)在695nm處有最大吸收波長(zhǎng)。抗氧化劑會(huì)和鉬會(huì)競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生還原反應(yīng)，從而影響綠色產(chǎn)物的生成量?？梢酝ㄟ^分光光度法通過測(cè)定吸光度來檢測(cè)鉬藍(lán)的產(chǎn)量，以此間接的反映出抗氧化劑的能力。吸光度值越高表明抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。在具塞試管中依次加入1.0mL(3mol／L)H₂S0₄溶液，1.0mL(0.14mol／L)Na₃P0₄溶液和1.0mL(0.2mol／L)鉬酸銨溶液，再分別加入1.0mol以上樣品溶液，蒸餾水定容至5.0mL搖勻，加塞于95℃水溶液中加熱90min，取出冷卻至室溫后在695nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

（7）清除亞酸鹽能力的測(cè)定

本試驗(yàn)中亞硝酸鹽清除能力的測(cè)定根據(jù)李佳穎等的方法，略作修改。準(zhǔn)確吸取0.5mL樣品溶液于試管中，分別加入5μg，mL亞硝酸鈉溶液250μL，振蕩均勻，加pH3.0的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液2.0mL，混勻后于37℃水浴30min。加入1mL濃度為0.4％對(duì)氨基苯磺酰胺和1mL濃度為0.2％鹽酸N-(1-萘基)-乙二胺，混勻并定容至刻度，靜置15min，于545nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度Ao。同用無水乙醇代替樣品其他條件不變，測(cè)得吸光值為氏；lmL濃度為0.2％鹽酸N-(1-萘基)-乙二胺換為1.0mL無水乙醇測(cè)定吸光值為A₂。按下式計(jì)算清除率(SA)。