（6）甘草渣總黃酮抗氧化能力測(cè)定

①甘草渣總黃酮對(duì)羥自由基（·OH）清除的測(cè)定甘草渣總黃酮對(duì)羥自由基（·0H）清除率按照Ren的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取不同濃度的甘草渣總黃酮溶液1.0mL于試管中，分別加入1.0mL10mmol/LFeSO₄溶液和10mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻后加入1.0mL10mmol/LH₂O₂溶液，在37℃水浴條件下反應(yīng)30min，在510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。使用蒸餾水替代H₂O₂作為參比對(duì)照，用蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，計(jì)算羥自由基（·OH）清除率。另外取與提取液總黃酮同等濃度的維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

式（2）中A₁為樣品溶液的吸光度；A₂為參比溶液吸光度；Ao為空白溶液的吸光度。

②甘草渣總黃酮對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

對(duì)DPPH自由基清除能力采用Brand的方法進(jìn)行測(cè)定。取1.0mL不同濃度的甘草渣總黃酮提取液于試管中，分別加入5mmol/LDPPH乙醇溶液1.0mL，混合均勻后暗室靜置30min，取2.0mL乙醇作為空白對(duì)照，1.0mL5mmol/LDPPH乙醇溶液與1.0mL乙醇混合液作為參比對(duì)照，于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率。另外取與提取液總黃酮同等濃度的維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。

式（3）中A₁為樣品溶液的吸光度；Ao為參比溶液的吸光度。

③甘草渣總黃酮總抗氧化能力測(cè)定

參考Oyaizu的方法對(duì)甘草渣總黃酮總抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，維生素C溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。取不同濃度的甘草渣總黃酮溶液1.0mL于試管中，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.0mL后混合均勻，50℃水浴反應(yīng)20min后立即冷卻至室溫，加入2.0mL10%三氯乙酸終止反應(yīng)。溶液在5000r/min條件下離心10min，取上清液2.0mL，再加入2.0mL蒸餾水和0.4mL0.1%FeCl₃溶液，混勻，暗室靜置反應(yīng)30min后于700nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

（7）數(shù)據(jù)分析

用Origin9.0繪制數(shù)據(jù)圖，用Design-Expert8.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

二、結(jié)果與分析

1、單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（1）料液比對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

按照精確稱(chēng)取2.0g甘草渣，分別以料液比1:25（g:mL）、1:30（g：mL）、1:35（g:mL）、1:40（g:mL）和1:45（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲30min，在60℃下回流提取2h方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。隨著溶劑用量的增多，總黃酮的收率呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溶劑用量較少時(shí)，總黃酮的收率隨著溶劑用量的增多而升高，可能是由于溶劑的增加使得溶液與甘草渣能夠充分接觸，促進(jìn)了黃酮的溶出，從而總黃酮收率也逐漸提高。當(dāng)料液比為1:35時(shí)，總黃酮收率達(dá)到最大。而當(dāng)料液比過(guò)大時(shí)，總黃酮收率下降，可能是由于料液比過(guò)高，造成雜質(zhì)溶出過(guò)多，從而使總黃酮收率有所降低。另外，考慮到生產(chǎn)成本以及后續(xù)工作的工作量，選擇料液比為1:35。

（2）超聲時(shí)間對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

按照精確稱(chēng)取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，分別超聲10min、20min、30min、40min、50min和60min，在60℃下回流提取2h中方法，固定其他條件，研究超聲時(shí)間對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響。由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間在10min～40min之間時(shí)，甘草渣總黃酮收率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)快速增加，可能是因?yàn)槌曌饔檬辜?xì)胞破裂，促進(jìn)總黃酮的溶出，從而提高其收率。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到50min時(shí)，總黃酮收率有所下降，可能是因?yàn)殡S超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞完全破裂，雜質(zhì)溶出過(guò)多，使總黃酮的溶解量減少，也可能是因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，破壞了總黃酮的結(jié)構(gòu)，從而降低了總黃酮的收率。因而響應(yīng)面優(yōu)化超聲時(shí)間條件水平選擇30min、40min和50min。

（3）提取時(shí)間對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

根據(jù)精確稱(chēng)取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，在60℃下分別提取lh、2h、3h和4h實(shí)驗(yàn)方法，固定其他條件，考察提取時(shí)間對(duì)總黃酮收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。可以看出，總黃酮收率隨著提取時(shí)間的增加呈先增大后平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為2h時(shí)，總黃酮收率達(dá)到最大。之后再增加提取時(shí)間，總黃酮收率幾乎沒(méi)有變化。因而響應(yīng)面優(yōu)化提取時(shí)間條件水平選擇lh、2h和3h。

（4）提取溫度對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響

按照精確稱(chēng)取2.0g甘草渣，以料液比1:35（g:mL）的比例加入70%乙醇溶液，超聲40min，分別在50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下提取2h試驗(yàn)方法對(duì)提取溫度對(duì)甘草渣總黃酮收率的影響進(jìn)行研究，理論上黃酮類(lèi)物質(zhì)易溶于熱水，溫度越高，總黃酮收率應(yīng)該越高。但研究結(jié)果并非如此，如圖5所示，隨著提取溫度的升高，總黃酮收率先增大后降低。當(dāng)提取溫度達(dá)到70℃時(shí)，溫度達(dá)到最大，之后再增加提取溫度，總黃酮收率反而減小，這可能是由于溫度過(guò)高，黃酮類(lèi)化合物較易分解，或者被氧化，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)遭到破壞的緣故，也可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高，溶劑揮發(fā)劇烈，導(dǎo)致有效溶劑相對(duì)減少，從而降低了總黃酮的收率。因而響應(yīng)面優(yōu)化提取溫度條件水平選擇60℃、70℃和80℃。
 

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