3.2補陽還五湯及其給藥人血漿、尿液藥物化學(xué)成分鑒定

本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)對補陽還五湯及其給藥人血漿和尿液藥物化學(xué)成分進行了分析，在分析過程中根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、分子離子特征碎片峰及其碎裂規(guī)律，在補陽還五湯中共鑒定了55個化合物；給藥后人的血漿中鑒定了34個化合物；在尿液中鑒定了23個化合物，結(jié)果見表1。

3.3補陽還五湯主要藥物化學(xué)成分的裂解規(guī)律

黃酮類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯及其在人血漿和尿液中黃酮及其苷類化合物的數(shù)量較多，且在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，例如牡荊素、紅橘素、木犀草素和毛蕊異黃酮及其苷類。以補陽還五湯中主要活性成分毛蕊異黃酮苷為例，其色譜保留時間為8.72 min，準分子離子峰為m/z 447.127 8[M+H]+，產(chǎn)生的二級特征離子碎片有m/z 285.075 1[M+H-C6H10O5]+為毛蕊異黃酮苷脫去1個葡萄糖后的特征碎片離子，m/z166.984 3[M+H-C13H14O7]?為毛蕊異黃酮苷的基本母核經(jīng)碎裂后得到的離子碎片。毛蕊異黃酮苷對照品提取離子流色譜圖(extracted ion chromatogram,XIC)和在湯劑中質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖2~3。

苯酸類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯及其在人血漿和尿液中苯酸類化合物的數(shù)量較多，且在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，例如阿魏酸、綠原酸、沒食子酸和高藜蘆酸等。以補陽還五湯中主要活性成分阿魏酸為例，其色譜保留時間為7.12 min，準分子離子峰為m/z 195.065 0[M+H]+，產(chǎn)生的二級特征離子碎片有m/z 177.054 5[M+H-H2O]+為阿魏酸脫去1個H2O后的特征碎片離子，m/z 149.012 1[M+H-H2O-CO]+為阿魏酸脫去1個H2O后再脫去1個CO的特征碎片離子。阿魏酸對照品XIC圖和在湯劑中質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖4~5。

苯酞類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯及其在人血漿和尿液中苯酞類化合物的數(shù)量較多，且在正離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，例如洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯H等。以補陽還五湯中主要活性成分洋川芎內(nèi)酯H為例，其色譜保留時間為10.05 min，準分子離子峰為m/z225.118[M+H]+，產(chǎn)生的二級特征離子碎片有m/z207.101 4[M+H-H2O]+為洋川芎內(nèi)酯H脫去1個H2O后的特征碎片離子，m/z 189.090 8[M+H-2H2O]+為洋川芎內(nèi)酯H脫去2H2O個的特征碎片離子。洋川芎內(nèi)酯H對照品XIC圖和在湯劑中質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖6~7。

皂苷類成分的裂解規(guī)律：研究發(fā)現(xiàn)補陽還五湯主要活性成分黃芪皂苷Ⅲ，其在負離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)較好，色譜保留時間為13.19 min，準分子離子峰為m/z 783.455 7[M-H]?和m/z 843.477 7[M+CH3COO]?，產(chǎn)生的二級特征離子碎片有m/z621.063 5[M-H-C6H10O5]+為黃芪皂苷Ⅲ脫去1個葡萄糖后的特征碎片離子，m/z 469.051 0[M-HC6H10O5-C5H9O4-H2O-2H]?為黃芪皂苷Ⅲ脫去1個葡萄糖，脫去1個木糖，1個水和2個氫后的特征碎片離子，此碎裂規(guī)律與文獻報道一致，黃芪皂苷Ⅲ對照品XIC圖和在湯劑中黃芪皂苷Ⅲ[M-H]?質(zhì)譜碎裂規(guī)律見圖8~9。

4討論

本研究建立的檢測方法在16 min完成了補陽還五湯及其在人血漿和尿液中的藥物化學(xué)成分的檢測，一共鑒定了61個化合物。本研究采用的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)，與文獻報道的HPLC-DAD-TOF/MS和UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)相比，具有更快的分析速度、更高的準確度和靈敏度。本研究在人的血漿中分析鑒定了34個化合物，尿液中分析鑒定了23個化合物。這些成分主要是黃酮、苯酸和苯酞，這與文獻豬的血清中主要成分存在一定的差異，豬的血清中主要成分以黃酮類化合物為主，其他化合物并沒有檢測到，這可能是當時的技術(shù)平臺和人與動物之間的吸收和代謝差異引起的。在人的血漿中和尿液中鑒定的化合物已被證明具有治療腦卒中的作用，如黃酮類化合物的蘆丁、毛蕊異黃酮、芒柄花素、毛蕊異黃酮苷和槲皮素等在體外已經(jīng)證明其可降低損傷大鼠腦細胞流動性。苯酸類化合物阿魏酸、綠原酸、沒食子酸等具有降低主動血管炎癥、改善急性心肌缺血、保護神經(jīng)細胞線粒體功能而降低神經(jīng)細胞損傷等作用。苯酞類成分洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯和洋川芎內(nèi)酯H等具有在抗氧化損傷、抗炎鎮(zhèn)痛、抗凝及抗血小板聚集、舒張血管等作用。結(jié)合各單個化合物藥理活性相關(guān)報道，初步推斷人血漿和尿液的藥效成分可能為補陽還五湯在人體內(nèi)發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

中藥進入體內(nèi)后發(fā)揮藥效的物質(zhì)有可能是藥物原型，也會是藥物的代謝產(chǎn)物。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，補陽還五湯的各個成分進入人體后，在血漿樣本和尿液樣本中檢測的代謝產(chǎn)物相對較少。目前還未見對補陽還五湯吸收進入人體后的代謝產(chǎn)物進行研究的文獻報道。本研究將在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上優(yōu)化實驗條件，進一步研究補陽還五湯進入人體后的代謝產(chǎn)物和其代謝途徑，為進一步揭示補陽還五湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供實驗參考。

本研究應(yīng)用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS技術(shù)完成了補陽還五湯和其給藥后在人血漿及尿液中藥物化學(xué)的快速分析，為揭示補陽還五湯治療缺血性腦卒中藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。

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