3、色譜分析條件

Agilent5HC-C18（2）（4.6×250mm，5μm）色譜柱，進(jìn)樣量20μL，流速1.0mL/min，柱溫35℃，以甲醇作為流動(dòng)相A，以0.02moI/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫條件見表1。使用二極管陣列檢測(cè)器，光譜范圍190～700nm；光譜步進(jìn)值為2.0nm，光譜采集模式。以保留時(shí)間及光譜圖定性，在230nm和625nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，峰面積外標(biāo)法定量。

二、結(jié)果與討論

1、色譜條件的優(yōu)化

本試驗(yàn)比較乙腈-0.02mol/L乙酸銨和甲醇-0.02mol/L乙酸銨按表1梯度進(jìn)行洗脫時(shí)，發(fā)現(xiàn)新紅與苯甲酸，靛藍(lán)與脫氫乙酸分離度達(dá)不到1.5的要求，原因可能有幾點(diǎn)：首先，乙腈洗脫能力比甲醇強(qiáng)，在UV波長(zhǎng)較短的色譜分析上具有較高靈敏度，且色譜級(jí)的乙腈是吸收能力比較小的有機(jī)溶劑，故乙腈過強(qiáng)的洗脫能力以及乙腈特有的性質(zhì)都會(huì)造成出峰時(shí)間靠前的目標(biāo)物和雜質(zhì)峰或者相鄰的峰分不開；其次，苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、納他霉素極性相較胭脂紅、日落黃、誘惑紅極性偏強(qiáng)，采用乙腈階梯式梯度洗脫，出峰速度快，無法控制基質(zhì)基線干擾；再者，糕點(diǎn)中的基質(zhì)大多數(shù)為無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、糖類等，乙腈洗脫不能有效避免這些基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾，試驗(yàn)中也通過調(diào)整梯度洗脫的比例，但是無論如何調(diào)整仍然無法將13種目標(biāo)物完全分離，然而采用甲醇洗脫能夠有效避免乙腈存在的這些問題，結(jié)果見圖1。本次試驗(yàn)還選擇了甲醇一0.02mol/L乙酸銨與甲醇-0.02mol/L磷酸二氫銨溶液進(jìn)行梯度洗脫，13種食品添加劑均為極性物質(zhì)，與水均能互溶，采用0.02mol/L磷酸二氫銨對(duì)防腐劑的分離沒有影響，但是這個(gè)水系的流動(dòng)相對(duì)色譜分離影響較大，大部分色譜均不能有效洗脫，結(jié)果見圖2，綜合考慮，本試驗(yàn)最終選擇甲醇一0.02mol/L乙酸銨按表1程序進(jìn)行分離。

2、樣品前處理優(yōu)化

（1）蛋白沉淀劑的選擇

人工合成色素與防腐劑、甜味劑的前處理方法不同，參考相關(guān)文獻(xiàn)，本次試驗(yàn)針對(duì)糕點(diǎn)中的基質(zhì)，選擇水系蛋白沉淀劑，即106g/L亞鐵氰化鉀和219g/L乙酸鋅溶液進(jìn)行處理，這兩種水系蛋白沉淀劑均為中性鹽，中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉淀蛋白質(zhì)是一種鹽析反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)是一種膠體，乙酸鋅與亞鐵氰化鉀反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅沉淀能夠挾走或吸附干擾物質(zhì)，且這兩種中性鹽除蛋白能力強(qiáng)，同時(shí)高濃度的鹽離子水化能力很強(qiáng)，能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分子的水化層奪取，鑒于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小不同，故鹽析所需的鹽濃度也不同，本次試驗(yàn)經(jīng)過反復(fù)測(cè)試，最終采用106g/L亞鐵氰化鉀溶液和219g/L乙酸鋅處理樣品中蛋白質(zhì)效果最佳。

（2）固相萃取柱的選擇

本次試驗(yàn)通過樣品加標(biāo)回收進(jìn)行考察，分別稱取陰性樣品6份，每份2.59，各精密加入標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液1.0mL，其余稱取粉碎均勻的糕點(diǎn)樣品2.5g置50mL離心管中，加25mL水，各加5mL106g/L亞鐵氰化鉀溶液和5mL219g/L乙酸鋅溶液，渦旋10min后，加水定容至50mL，經(jīng)10000r/min冷凍離心10min后取出，量取上清液5mL過QasisWAX固相萃取小柱（預(yù)先經(jīng)3mL甲醇以及3mL水活化），棄去流出液，依次用6mL2％甲酸和6mL純化水清洗，再用5％氨化甲醇洗脫并收集于15mL離心管中，在40℃水浴中氮吹至近干后取出放置室溫，用5mL水復(fù)溶殘?jiān)?，過0.45μmGHP微孔濾膜后，待測(cè)。

結(jié)果見表2，從結(jié)果可以看出，WatersOasisWAX固相萃取小柱回收率最高，對(duì)本次試驗(yàn)的13種食品添加劑富集比較好，WatersOasisHLB固相萃取小柱和WatersOasisMCX固相萃取小柱回收率次之，原因可能是，WatersOasisWAX固相萃取小柱特點(diǎn)為混合型弱陰離子交換反相吸附劑，具有弱陰離子交換和非極性疏水雙重作用的混合吸附劑，對(duì)強(qiáng)酸性化合物具有高的選擇性和靈敏度，含弱堿性的胺基功能基團(tuán)，適用于從堿性或中性物質(zhì)中分離純化酸性物質(zhì)，可用于強(qiáng)酸性化合物的處理，本次試驗(yàn)的13種添加劑均為水溶性化合物，采用WAX進(jìn)行富集，2％甲酸清洗能夠?qū)悠分须x子狀態(tài)的雜質(zhì)清洗去除，再用5％氨化甲醇將富集在固相萃取小柱分子狀態(tài)的添加劑進(jìn)行離子化洗脫下來；WatersOasisHLB內(nèi)的吸附劑是通過一個(gè)“特殊的極性捕獲基團(tuán)”來增加對(duì)極性物質(zhì)的保留提供很好的水浸潤(rùn)性，用于酸性，中性和堿性化合物的通用型吸附劑，這種性質(zhì)用于分析人工合成色素極好的，但是這個(gè)小柱對(duì)防腐劑中的納他霉素和富馬酸二甲酯的保留富集效果較差，原因可能是HLB內(nèi)填料是親脂性化合物，而納他霉素和富馬酸-ep酯是親水性的，WatersOasisMCX固相萃取小柱是混合型陽離子交換反相吸附劑，對(duì)堿性化合物具有高的選擇性和靈敏度，MCX小柱對(duì)部分色素和防腐劑的富集效果也比較差，不能同時(shí)對(duì)13種成分進(jìn)行分析，故本次試驗(yàn)選擇WatersOasisWAX固相萃取小柱進(jìn)行。

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