一、引言

夏枯草(學名為PrunellavulgarisLinn英文名為CommonSelJheal)，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗。夏枯草功能繁多，如降血壓、降血脂、抗菌、抗病毒、降糖、抗炎及免疫抑制、治療頭疼眩暈、抑制食管癌ECa109腫瘤細胞的增殖、調控Raji細胞生長與凋亡、清除DPPH自由基和較強的抗氧化性。另外夏枯草作為一種藥食同源的中藥，其開發(fā)價值和開發(fā)前景非常廣闊，但夏枯草在壽命方面的研究報道尚少。

草在壽命方面的研究報道尚少。本研究選用黑腹果蠅作為模式生物對夏枯草水提取物進行抗衰老作用研究。將夏枯草水提取物進行不同程度的稀釋，并分別添加到培養(yǎng)基中飼喂果蠅進行壽命實驗，在壽命實驗的基礎上，發(fā)現(xiàn)最高濃度的夏枯草水提物可以延長雌性果蠅壽命，因而對最高濃度進行了深入的研究，以一定時間內(nèi)雌性果蠅產(chǎn)卵數(shù)目來評價夏枯草水提物對果蠅生殖系統(tǒng)的影響，以每分鐘的活動次數(shù)來評價夏枯草水提物對果蠅睡眠的影響，以果蠅進食量來評價夏枯草對果蠅熱量攝入的影響。為夏枯草在醫(yī)藥、保健品、飲料等相關產(chǎn)品的應用提供參考。

一、材料與方法

1、材料與儀器

夏枯草購買自本草鋪，黑腹果蠅，美國BloomingtonDrosophilaStockCenter(BDSC)購買所得，基因型為Canton-S。

對羥基苯甲酸乙酯、瓊脂粉、無水氯化鈣、葡萄糖，均購買于國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR；千島湖純凈水、白砂糖、玉米粉，以上均購買自普通農(nóng)貿(mào)市場；安琪酵母粉，京東；無水乙醇、95％乙醇以及丙酸，購買于杭州米克化工儀器有限公司；亮藍，阿拉丁(上海)。

智能人工氣候箱，寧波萊?？萍加邢薰荆凰疅岷铣煞磻?，西安常儀儀器設備有限公司內(nèi)膽為聚四氟乙烯；電熱恒溫鼓風干燥機，上海精宏鼓風干燥箱DHG-9426ASHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，邦西儀器科技(上海)有限責任公司；0.229m水系濾膜，生工生物工程(上海)股份有限公司；果蠅活動監(jiān)測器，美國Trikinetics公司；手動組織研磨器，生工生物工程(上海)股份有限公司l酶標儀，ThermoFisher；離心機，ThermoFisher；透明水浴鍋，金壇實驗儀器。

2、方法

（1）中藥成分的提取

采用水熱合成反應釜高溫提取Illl，取夏枯草1.59加入60mL水，在lOOmL反應釜中，放入電熱恒溫鼓風干燥機中，反應條件為100℃，反應時間為3h，后冷卻至室溫，用229m水系濾膜真空抽濾機過濾，得到夏枯草水提物40mL(下文使用夏枯草水提物代指此步驟得到的溶液)。

（2）果蠅培養(yǎng)基

高熱量(3.0X)培養(yǎng)基每升含瓊脂15g、酵母300g、白砂糖50g、氯化鈣0.7126g、對羥基苯甲酸乙酯9g溶于30mL的95％乙醇中、丙酸6mL，用來進行壽命實驗。

(3)壽命實驗方法

收集24小時內(nèi)羽化的果蠅，進行隨機分組并放置到新的果蠅管中，每管約為40只果蠅，使雌性果蠅與雄性果蠅隨機完成交配。48h后，對交配過的果蠅進行區(qū)分雌雄，然后隨機分組，每管中40只果蠅。壽命實驗分為4個不同濃度：對照組(添加等量的蒸餾水100μL)、低濃度(1∶100稀釋的粗提取液1009L)、中間濃度(1∶10稀釋的粗提取液lOOgL)、高濃度(母液100μL)，每個性別3管。實驗所用溫度為25℃(相對濕度為60％±5％，12h亮12h暗)。實驗每隔一天(0、2、4、6、……)定時為果蠅更換培養(yǎng)基，并統(tǒng)計死亡果蠅的數(shù)目，記錄下每天果蠅的死亡數(shù)量。延壽率=[(實驗組平均壽命一對照組平均壽命)］／對照組平均壽命×100％。

(4)進食量測定實驗

參考文獻收集方法，收集10天齡的雌雄果蠅各120只，對照組和實驗組各60只，每個濃度分成3管，每管20只果蠅。實驗所用基礎培養(yǎng)基與壽命實驗相同，在食物表面添加200μL濃度10.8％的亮藍溶液、水1OOμL作為對照組，100μL夏枯草水提物作為實驗組。將果蠅分別放入上述培養(yǎng)基中3h，之后零下18℃冷凍lh，加入1200μL去離子水，用手動組織研磨器研磨碎，高速恒溫離心機9000r／min離心15min，取上清液200μL放入酶標儀中629nm處測量吸光度。

（5）熱刺激

參考文獻方法，收集10天齡的雌果蠅80只，對照組和實驗組各40只，每個濃度4管，每管10只。將果蠅放人干空的果蠅管中，放入39℃的透明水浴鍋中，每10min記錄一次果蠅的死亡數(shù)量(果蠅面朝上躺在果蠅管底部，且20s內(nèi)不再抽搐，則記錄為死亡)。

（6）產(chǎn)卵實驗

參考文獻方法，收集10天齡的雌果蠅200只，對照組和實驗組各100只，每個濃度5管，每管20只雌果蠅。實驗所用基礎培養(yǎng)基與壽命實驗相同，在食物表面添加200μL濃度10．8％的亮藍溶液、水100μL作為對照組，lOOμL夏枯草作為實驗組。將果蠅放在上述處理之后的食物上，并放到與壽命相同條件的培養(yǎng)箱中，22h之后，清除雌果蠅，顯微鏡下計數(shù)果蠅卵的個數(shù)。

（7）睡眠分析方法

參考文獻方法，收集10天齡的雌雄果蠅各80只，對照組和實驗組各40只，每個濃度分成4管，每管10只果蠅。實驗所用基礎培養(yǎng)基與壽命實驗相同，在食物表面添加水100I_tL作為對照組，lOOgL夏枯草作為實驗組。放入Trikinetics公司的DAM儀器中進行監(jiān)測，隔26h之后更換對照與實驗組位置繼續(xù)監(jiān)測，使用pysolo進行數(shù)據(jù)分析，大于5分鐘活動為0則認為果蠅在睡眠。

3、統(tǒng)計學分析

使用SPSSl7.0軟件對果蠅壽命進行分析和OASIS結合Python的lifelines庫(主要用于計算P—value)。

二、結果與分析

1、夏枯草水提物對果蠅壽命的影響

如表l所示不同濃度的夏枯草水提物對雌雄果蠅的平均壽命、最大壽命的影響，進食最高濃度的夏枯草水提物的雌性果蠅壽命相比較對照組有顯著差異(P＜0.05)，延長平均壽命10.54％、中值壽命10％、最大壽命20％。其他濃度對雌性果蠅均沒有效果，所有濃度對于雄性果蠅均沒有效果。結果表明夏枯草水提物可以延長果蠅的壽命，但是具有性別差異性。

2、夏枯草水提物對果蠅進食量的影響

壽命與熱量的攝人有密切的關系，另外由于壽命實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)最高濃度的夏枯草水提物可以延長雌性果蠅的壽命，所以需要確定這種延長是否是通過抑制進食量達到的。亮藍是一種藍色染料，果蠅進食之后會使其腸道染色，從而根據(jù)亮藍含量的多少來檢測進食量的多少，亮藍的含量可以通過在629nm處的吸光度來檢測，吸光度越大含量越高。

通過圖1分析得到，進食高濃度夏枯草水提物之后會提高果蠅的進食量，其中雌性提高24.42％(P＜0.05)。雄性提高37.4％(P＜0.05)。

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