蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是一種兼性需氧的革蘭氏陽性菌，產芽胞，廣泛分布于土壤、水、空氣和各類生熟食品中。食用了該菌污染的食品容易導致食物中毒，引起的食物中毒類型主要包括腹瀉型中毒和嘔吐型中毒，其中腹瀉型中毒主要與某些菌株分泌腸毒素相關，而嘔吐型中毒主要是由于某些菌株產生嘔吐毒素引起。

國內外均有報道蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒事件。1950年在挪威發(fā)表了第一起蠟樣芽胞桿菌食物中毒的報告，之后許多國家，尤其是歐洲一些國家相繼報告了類似食物中毒的爆發(fā)。挪威和荷蘭將蠟樣芽胞桿菌認定為食品中最易檢出的病原微生物。我國在上世紀70年代報道蠟樣芽胞桿菌中毒事件后，此類中毒事件的報道逐年增多。據2008~2015年我國國家食源性疾病監(jiān)測網統(tǒng)計資料顯示，微生物性食源性疾病占比39%，其中蠟樣芽胞桿菌引起的中毒事件占17%，在細菌性病原體中排在第三，危害極為嚴重。嘔吐型蠟樣芽胞桿菌引發(fā)的食物中毒時有發(fā)生，約占蠟樣芽胞桿菌食物中毒總數的75.9%。因此，建立一種快速、特異的方法檢測食品中產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌至關重要。

目前檢測蠟樣芽胞桿菌的方法是食品安全國家標準食品微生物學檢驗蠟樣芽胞桿菌（GB4789.14-2014），主要包括增菌、分離培養(yǎng)、鏡檢、生化鑒定、生化分型。對于分離的蠟樣芽胞桿菌主要是采用PCR或熒光定量PCR的方法鑒定其是否是嘔吐毒株（嘔吐毒素合成酶基因存在與否）。環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新興的檢測技術，它以其特異性強、等溫靈敏、操作簡單、產物易檢測等優(yōu)點在食品安全檢測等領域得到了日益廣泛的應用。在食源性致病菌方面，目前已經建立了副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）、沙門氏菌（Salmonella spp.）、克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）和蠟樣芽胞桿菌等致病菌的LAMP技術，但沒有從蠟樣芽胞桿菌中區(qū)分出產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的LAMP檢測方法報道。本研究旨在以產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌基因cesB為靶基因，設計LAMP反應特異性引物，構建LAMP反應體系，建立一種產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的特異快速檢測技術，為衛(wèi)生檢驗和食品質量安全提供技術保障，不斷提高我國食品安全與公共衛(wèi)生控制水平。

1材料與方法

1.1菌株

本試驗收集菌株62株，所有菌株均由廣東省微生物研究所提供。

1.2培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨肉湯、LB肉湯等培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Bst DNA聚合酶：NEB公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，2×PCR Mix：廣州東盛生物科技有限公司；顯色劑：廣州迪奧生物科技有限公司；dNTPs，DNA Marker2000：生工生物工程（上海）股份有限公司；MgSO4和甜菜堿：Sigma公司。

1.3主要儀器

低溫高速離心機：SIGMA 3K30，德國sigma公司；酶標儀：EPOCH2，美國BioTek公司；PCR儀：Mini3220，杭州朗基科學儀器有限公司；電泳儀：DDR-6B，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)：Tanon-4600SF，上海天能科技有限公司；移液槍：德國Eppendorf公司；生化培養(yǎng)箱：SPX-150B-Z，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；恒溫水浴鍋：XMTD-8222，上海精宏實驗設備有限公司。

1.4方法

1.4.1細菌培養(yǎng)

將菌株接種至在胰蛋白胨肉湯（TSB）培養(yǎng)，（36±1）℃培養(yǎng)16~18 h。

1.4.2 DNA抽提

試劑盒法：按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。煮沸法：取1 mL菌液或樣品增菌液于12000 r/min離心5 min，棄上清。加入200μL無菌水洗滌1次后，用100μL TE懸浮混勻，于100℃水浴10 min，冰浴3 min，12000 r/min離心5 min，取上清備用。

1.4.3引物設計

（1）LAMP引物設計：以產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌cesB為靶基因，設計LAMP引物，引物序列見表1，由上海生物工程公司合成。（2）PCR引物：參考文獻序列，由上海生物工程公司合成。

1.4.4 LAMP擴增

LAMP反應體系25μL，包括2.5μL10×Thermopol反應緩沖液、1.6 mmol/L dNTPs、0.2μmol/L上游外引物F3、0.2μmol/L下游外引物B3、1.6μmol/L上游內引物FIP、1.6μmol/L下游內引物BIP、6 mmol/L MgSO4、1 mol/L甜菜堿、8 U Bst DNA聚合酶、3μL細菌DNA模板，加dd H2O至體積25μL，加入顯色劑在PCR管蓋。擴增反應條件：63℃恒溫水浴1 h，不用開蓋，通過顏色直接觀察結果。

1.4.5 PCR擴增

PCR反應體系和PCR擴增程序參考張志鴻等的報道。用1×TAE電泳緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠，上5μL，100 V電壓下30 min電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果并進行分析。

1.4.6 LAMP特異性驗證

將表2中所有菌株接種至TSB增菌液中37℃培養(yǎng)16~18 h后，取1 mL菌液用煮沸法提取DNA，然后進行LAMP擴增，驗證LAMP反應體系的特異性。

1.4.7 LAMP靈敏度評價

1.4.7.1基因組靈敏度

將產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72在TSB增菌液中37℃培養(yǎng)16~18 h后，取1 mL菌液，用DNA抽提試劑盒抽提DNA，用酶標儀測定DNA濃度。將上述DNA進行梯度稀釋，進行LAMP擴增，評價該方法的DNA靈敏度。

1.4.7.2純菌靈敏度

將產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌F4810/72在TSB增菌液中37℃培養(yǎng)16~18 h后，取1 mL菌液，進行梯度稀釋，用DNA抽提試劑盒抽提不同稀釋度的DNA，進行LAMP擴增，評價該方法的純菌靈敏度。同時對含不同稀釋度的菌液進行平板計數。

1.4.8人工污染樣品檢測

稱取經國標方法檢驗不含蠟樣芽胞桿菌的新鮮米飯樣品25 g至225 mL LB培養(yǎng)基中，接種計數的產嘔吐毒素的蠟樣芽胞桿菌F4810/72菌液，人工模擬樣品的最終濃度分別為100CFU/g、101CFU/g、102CFU/g和103CFU/g，37℃靜置培養(yǎng)，在0、2、4和6 h后分別從增菌培養(yǎng)基中取1 mL上清液于無菌離心管中，提取DNA進行LAMP檢測。同時對含不同稀釋度的菌液進行平板計數。

1.4.9食品中產嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌的檢測

購買各大超市和快餐店的食品72份，其中熟食24份，水產品24份，奶制品24份。每份樣品平均分成2份，一份按GB 4789.14-2014分離檢測；另一份直接用胰酪胨大豆多黏菌素肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)，取1.5 mL增菌液按上述煮沸法提取DNA，進行LAMP檢測。

聲明：本文所用圖片、文字來源《現代食品科技》2020年12月8日，版權歸原作者所有。如涉及作品內容、版權等問題，請與本網聯系

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