仙草，又名涼粉草、仙人草，為唇形科涼粉草，屬一年生草本植物。在國內(nèi)主要產(chǎn)于廣東、福建、廣西、江西、云南等省份。國家衛(wèi)生和計(jì)劃委員會(huì)在2010年3月發(fā)布[2010年]第3號(hào)公告，允許仙草作為普通食品生產(chǎn)經(jīng)營，仙草被列入了中國食同源植物目錄。

仙草作為重要的藥用和食用植物資源，含有豐富的營養(yǎng)成分，仙草全草干樣含有約70％碳水化合物，少量蛋白質(zhì)、脂肪、色素等，還含有較多的礦物質(zhì)元素，是一種重要的藥食兩用的植物資源。在本草中記載仙草的藥用功效廣泛，具有治療腎臟病、糖尿病、關(guān)節(jié)肌肉疼痛、淋病，清暑、解熱利水、消渴、降血壓，抗衰老、抗癌等功能。是天然、安全、保健、營養(yǎng)食品較理想的原料，其加工利用價(jià)值也非常廣泛，例如龜苓膏、仙草奶茶/涼茶、食用涼粉果膠等以仙草粉為主料，加多寶等涼茶飲料和其他一些牌子酸奶等飲料配表中也見含有仙草粉，對(duì)仙草粉的研究應(yīng)用已成為熱點(diǎn)。產(chǎn)品在東南亞國家及地區(qū)很受歡迎。

近兩年，國內(nèi)出口的仙草加工食品中，檢出了苯甲酸類物質(zhì)，在國際經(jīng)濟(jì)形勢(shì)下滑，出口低迷，國外對(duì)輸入的產(chǎn)品控制越來越嚴(yán)格，有些國家及地區(qū)規(guī)定不能在該產(chǎn)品中添加苯甲酸類防腐劑，對(duì)生產(chǎn)企業(yè)的出口貿(mào)易造成了較大的影響。苯甲酸和山梨酸是食品工業(yè)中常用的防腐劑，能有效防止酵母、霉菌、細(xì)菌的生長(zhǎng)。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2014中明確規(guī)定了苯甲酸的最大使用限量。

目前，苯甲酸的檢測(cè)方法有食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.28—2016，兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)均為液相色譜法。王海華等、鄭玲等、何日安等均研究過液相色譜測(cè)定仙草中苯甲酸類物質(zhì)。由于單純的色譜法只通過保留時(shí)間進(jìn)行定性，專屬性和特異性較差，易產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，有文獻(xiàn)報(bào)道采用色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)飲料和調(diào)味料中的苯甲酸。尚未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外關(guān)于使用高效液相色譜～質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定仙草中苯甲酸的文章和報(bào)道。本文利用液液萃取法提取仙草中、仙草產(chǎn)品中的苯甲酸，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），可以對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量，結(jié)果滿意。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1、儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀LcMs8040，配電噴霧離子源（EsI）（日本島津公司）；超純水儀：Sanorius-comfort-I-8-TOc（德國賽多利斯公司）；振蕩儀YAMATOSA300（日本YamatoScientificCo，Ltd）。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品（GBw（E）0822621000μg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；乙酸銨：GR級(jí)（天津大茂）；乙腈：HPLc級(jí)（美國默克）；其他試劑為分析純?cè)噭?/p>

2、儀器條件

（1）色譜條件色譜柱

Shim-packGIST2.0mmI．D×150mmL，2.0μm；流動(dòng)相A：0.2mmol/L乙酸銨水溶液，B：乙腈，等度洗脫（A/B=70/30）；流速（0.4mL/min）；柱溫：40℃。進(jìn)樣量10μL。

（2）質(zhì)譜條件離子化模式

ESI（一）；離子噴霧電壓：4.5kV；霧化氣：氮?dú)?.0L/min；干燥氣：氮?dú)?5L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；駐留時(shí)間：20ms；延遲時(shí)間：3ms；MRM參數(shù)：見表1。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液1000mg/L，用流動(dòng)相稀釋得到0.00、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/L濃度點(diǎn)。

4、樣品前處理

稱取樣品1～29，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入1.0mL鹽酸溶液（1∶1）酸化，加入氯化鈉1g，分別用20mL、10mL乙醚提取兩次，每次振搖10min，將上層乙醚提取液吸出放另一離心管中，合并兩次乙醚提取液。提取液過無水硫酸鈉（馬輻爐450℃燒4h），用5mL乙醚淋洗，收集乙醚，40℃氮?dú)馑〈蹈?，加?mL流動(dòng)相蝸旋溶解，過0.22um濾膜備用。

5、樣品的測(cè)定

按Shim-packGIST2.0mmI．D×150mmL，2.0μm；流動(dòng)相A：0.2mmol/L乙酸銨水溶液，B：乙腈，等度洗脫（A/B=70/30）；流速（0.4mL/min）；柱溫：40℃。進(jìn)樣量10μL對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液及提取凈化樣品進(jìn)行測(cè)試，外標(biāo)法定量。

二、結(jié)果與討論

1、色譜條件的選擇

采用液相色串聯(lián)譜質(zhì)譜法檢測(cè)苯甲酸，實(shí)驗(yàn)室參考國標(biāo)GB/T23495—2009方法，分離的色譜柱選用C18進(jìn)行分析（2.1μm，2.1×150mm）。離子化模式：ESl（一），選擇水-乙腈作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，苯甲酸出現(xiàn)峰展寬及拖尾現(xiàn)象，這是由于苯甲酸帶有與弱極性基團(tuán)，而C18色譜柱帶有硅羥基結(jié)構(gòu)，而硅羥基與苯甲酸上的羥基發(fā)生弱離子交換作用，導(dǎo)致峰展寬。Horiyama等通過在流動(dòng)相中加人緩沖鹽來改善分離效果。王祖翔等通過在流動(dòng)相中加人0.2mmol/L乙酸銨可以明顯改善分離效果，本實(shí)驗(yàn)室參照該條件，配置0.2mm01/L乙酸銨和乙腈作為流動(dòng)相，由于分析單物質(zhì)，本研究使用等度洗脫，配制濃度為1mg/L點(diǎn)，流動(dòng)相比例（0.2mmol/L乙酸銨/乙腈（v/v））：（90/10）、（85/15）、（80，20）、（70/30）的比例進(jìn)行洗脫，從峰形、響應(yīng)、保留時(shí)間分析，（70/30）配比可以達(dá)到較好的結(jié)果，不同流動(dòng)相配比對(duì)峰型的影響見圖1～4。
 

2、質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制苯甲酸濃度為1mg/L，在Q3scan掃描模式下，同時(shí)進(jìn)行正離子模式和負(fù)離子模式采集，試驗(yàn)結(jié)果表明：負(fù)離子模式獲得較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子信號(hào)，干擾相對(duì)較少。這與苯甲酸分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，苯甲酸有羧酸結(jié)構(gòu)，易電離生成羧基，從而在負(fù)模式下更容易得到較強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子，因此實(shí)驗(yàn)室選擇了負(fù)離子模式。通過直接進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)譜自動(dòng)優(yōu)化得到苯甲酸：定量離子對(duì)為121.0/77.0。

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