菊粉（Inulin）又稱菊糖是由D-呋喃果糖分子以β-（1，2）糖苷鍵連接而成的多聚果糖，在每個菊粉分子的末端連接有一個葡萄糖殘基，呈直鏈結(jié)構(gòu)，聚合度一般為30左右。菊粉廣泛存在于菊苣和菊芋中。其中菊芋在我國廣泛種植，產(chǎn)量高，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，種植成本低，是一種開發(fā)利用前景廣闊的作物。菊粉水解產(chǎn)生的高果糖漿相比于其它方式具有更高的果糖含量。

菊粉酶（Inulinase）是能水解β-2，1-D果聚糖果糖苷鍵一類酶，系統(tǒng)名為β-2，1-D果聚糖酶，屬糖基水解酶32家族（Glycosylhydrolasesfamily32），菊粉水解酶主要來源于菊科植物組織和部分微生物。菊粉酶可以催化菊粉水解為果糖或低聚果糖。菊粉酶按照作用方式不同分為外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶，外切型菊粉酶作用于菊粉鏈的非還原性末端的糖苷鍵，逐一水解釋放出果糖，主要產(chǎn)物為果糖；內(nèi)切型菊粉酶隨機(jī)地?cái)嚅_菊粉鏈內(nèi)部的糖苷鍵，水解產(chǎn)物主要為低聚果糖。

果糖作為一種單糖存在于許多水果和蔬菜中如葡萄干、蘋果、葡萄、生胡蘿卜、洋蔥等。在自然界中，它也作為蔗糖、棉子糖、菊粉和水蘇糖的形成單元存在。果糖的甜度是蔗糖的1.5～2倍。它在人體中起到一系列的生理作用包括繞過葡萄糖代謝途徑，降低血糖指數(shù)，提高鐵吸收，加速乙醇代謝，防止肥胖和動脈粥樣硬化等。傳統(tǒng)上生產(chǎn)高果糖漿的方法是將淀粉水解后產(chǎn)生的葡萄糖異構(gòu)化。但是淀粉在處理之前要先進(jìn)行凝膠化，并且該過程需要大量的能量。同時，葡萄糖異構(gòu)化生產(chǎn)果糖的工藝受到較強(qiáng)的熱力學(xué)限制：葡萄糖和果糖的平衡濃度約為50%。本文采用酶水解法對高果糖漿制備工藝進(jìn)行研究，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合正交試驗(yàn)進(jìn)行研究，得出最優(yōu)的反應(yīng)條件，為工業(yè)生產(chǎn)高果糖漿提供理論依據(jù)和參考。

一、方法與步驟

1、材料與儀器

（1）儀器與設(shè)備UV-2800紫外分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州普天儀器有限公司；ALB-124電子天平，賽多利斯（北京）科學(xué)儀器有限公司；JJ-1增力電動攪拌器，上海梅香儀器有限公司；SHK-IIIS循環(huán)水式多用真空泵，鄭州科泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限

（2）原料與試劑

菊粉由西安昌岳生物科技有限公司提供，菊粉外切酶由鄭州百利化工產(chǎn)品有限公司提供，氫氧化鈉：天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司；亞硫酸鈉，結(jié)晶苯酚：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；3-5二硝基水楊酸，D-果糖：上海展云化工有限公司，以上試劑均為分析純。

2、實(shí)驗(yàn)方法

（1）酶解實(shí)驗(yàn)

稱取定量菊粉溶于蒸餾水定容至100mL，使用醋酸緩沖液調(diào)節(jié)其pH，每12h測量一次還原糖含量。以還原糖得率為指標(biāo)，研究溫度、底物濃度、pH、加酶量對菊粉酶解的影響。

（2）酶活測定

菊粉酶活力的測定參照Vincenza等人的方法在下列確定的條件下測量酶活性：溫度60°C，pH=5，反應(yīng)時間為20min。酶活性的定義為在上述標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化lμmol還原糖所需的酶量為一個酶活單位，用U表示。

（3）還原糖檢測方法

取過濾后酶解液1mL定容至100mL，取2mL加入3mLDNS試劑，沸水加熱5min，流水冷卻至室溫后在加入5mL蒸餾水至10mL于540nm下檢測吸光度。以果糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制曲線?；貧w方程為：y=0.05585x+0.00529，相關(guān)系數(shù)R²為0.991，還原糖濃度曲線的回歸性較好，可以進(jìn)行定量

（4）還原糖得率計(jì)算

經(jīng)檢測菊粉原料中還原糖含量為3%。還原糖得率的計(jì)算公式如下，其中Y為得率，m為酶解液中總還原糖質(zhì)量，m為原料中還原糖質(zhì)量，M為原料總質(zhì)量。

3、試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）單因素試驗(yàn)

在底物濃度為30g/L，pH為7和加酶量為40U/g的條件下，考察溫度對菊粉酶解液中還原糖得率的影響；在溫度為55⁰C，pH為7和加酶量為40U/g的條件下，考察底物濃度對菊粉酶解液中還原糖得率的影響；在溫度為550C，底物濃度為30g/L和加酶量為40U/g的條件下，考察pH對菊粉酶解液中還原糖得率的影響；在溫度為55⁰C，pH為7和底物濃度為30g/L的條件下，考察加酶量對菊粉酶解液中還原糖得率的影響。

（2）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)60h以后還原糖得率的增速變緩，綜合經(jīng)濟(jì)因素選定60h作為正交試驗(yàn)的反應(yīng)時間。在單一素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以溫度、pH、底物濃度和加酶量進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素及水平見表1。

二、結(jié)果分析

1、單因素試驗(yàn)結(jié)果

（1）溫度

溫度對菊粉酶解液還原糖得率的影響，見圖1。在較低溫度范圍內(nèi)，酶活隨溫度的升高而增大，55⁰C時菊糖酶解效果達(dá)到最好。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時酶解效果降低，在60⁰C時效果驟降推斷是由于溫度升高導(dǎo)致酶活性降低所致。因此選擇55⁰C、50⁰C、45⁰C進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。
 

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