（3）反應(yīng)時(shí)間的選擇。取8支比色管，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后分別置于沸水浴中，按照6min、8min、10min、12min、14min、16min、18min、20min的反應(yīng)時(shí)間，考察最后吸光值的變化情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在6－13min，溶液的顏色較淺，顯色不完全，吸光度也較小，隨著水浴時(shí)間的延長(zhǎng)，尿素顯色反應(yīng)吸光值呈逐漸上升趨勢(shì)，增加較明顯；在14－18min，溶液的吸光度比較穩(wěn)定，可顯色完全，吸光值基本達(dá)到最大值。為了提高效率，沸水浴時(shí)間定為14min。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。取8支25mL具塞比色管，分別加入100mg/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)使用液0mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL。在上述各管中分別加入2.0mL二乙酰一肟溶液，再加入三氯化鐵－氨基硫脲－硫酸混合試劑10.0mL，混勻后用純水稀釋至25mL。分別配制成0mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L、32mg/L、40mg/L的尿素標(biāo)準(zhǔn)系列，相當(dāng)于
每個(gè)管中相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量為0.00mg、0.05mg、0.10mg、0.20mg、0.40mg、0.60mg、0.80mg、
1.00mg。將上述各管在沸水浴中加熱14min，置流動(dòng)自來(lái)水中冷卻2min。以純水作參比，用1cm比色
皿，在525nm處測(cè)定各管吸光度值，以尿素含量對(duì)吸光度做回歸分析。根據(jù)最佳實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行吸光度的檢測(cè)，得到不同濃度的尿素和吸光度的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：y＝0.7629x＋0.0331，相關(guān)系數(shù)：r＝0.9992。詳見(jiàn)表1和圖4。

（5）精密度測(cè)定。對(duì)同一種乳樣的尿素含量平行測(cè)樣9次，先由繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品管中尿素的質(zhì)量，再由下述公式計(jì)算得出結(jié)果，如表2所示。

由表2可以看出，該方法精密度較好，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0％。

（6）乳樣中尿素回收率的測(cè)定。取同一品牌乳樣3份，其中1份作為本底樣處理，另外2份添加不同濃度的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻靜置。同時(shí)對(duì)3份樣品前處理后，再按上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)如下公式來(lái)計(jì)算樣品回收率，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，該方法的回收率較好，低濃度和高濃度加標(biāo)回收均達(dá)到97％。

4.乳樣中尿素含量的測(cè)定結(jié)果。根據(jù)最佳實(shí)驗(yàn)條件，按照實(shí)驗(yàn)方法對(duì)12種不同品牌牛乳中尿素的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表4所示。

三、討論
利用二乙酰一肟分光光度法來(lái)測(cè)定牛乳中尿素的含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)r＝0.9992，檢出限為0.020mg/L，樣品測(cè)定的精密度為RSD＝1.9％（n＝9），低濃度和高濃度加標(biāo)回收均達(dá)到97％。該方法
操作簡(jiǎn)單快速，可以很好地應(yīng)用于日常對(duì)牛乳中尿素含量的檢測(cè)。運(yùn)用該法對(duì)超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的12種不同袋裝奶及散裝奶中尿素含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，尿素含量最低的是10#樣品（159mg/L），含量最高為11#樣品（645mg/L），大部分測(cè)定結(jié)果在200－400mg/L左右。杜彥山、張志國(guó)等人曾測(cè)得牛奶中尿素含量為224.7mg/L，和本實(shí)驗(yàn)中的幾個(gè)數(shù)據(jù)較為接近，但5#、9#、11#樣品的尿素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于300mg/L，很有可能是摻假牛乳。

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