細胞水平染料木素協(xié)同維生素D3的抗骨質疏松作用（一）

發(fā)布時間：2021-12-31 21:01 編輯者：特邀作者周世紅

骨質疏松癥是一種常見的代謝性骨病。世界衛(wèi)生組織在2015年提出的《關于老齡化與健康的全球報告》指出，在國家和全球層面上需要重新和持續(xù)關注改善肌肉骨骼健康。骨重建過程取決于維持成骨細胞形成骨基質與破骨細胞消除骨礦化之間的平衡。成骨細胞響應骨細胞產(chǎn)生的信號，并將破骨細胞前體募集到重塑部位，然后，通過骨保護素（OPG）/核因子κB配體受體激活劑（RANKL）/核因子κB受體激活劑（RANK）系統(tǒng)的受體激活劑，成骨細胞可調節(jié)破骨細胞的生成。

骨質疏松癥主要是體內維生素D缺乏，鈣攝入量不足以及雌激素下降引起的。目前，人們普遍接受雌激素替代療法用于治療因缺乏雌激素的骨質疏松癥患者。然而其有副作用，尤其是增加乳腺癌的風險。維生素D3（VitaminD₃，VD₃）是骨形成系統(tǒng)中的重要參與者，在鈣穩(wěn)態(tài)中具有增加鈣從腸道吸收的功能。飲食中攝入足夠的維生素D3是必要的，其廣泛存在于油性魚和鱈魚肝油中。染料木素（Genistein，Gen）是常見的異黃酮植物雌激素化合物之一，在大豆中的含量豐富，也是可食用的天然物質，能夠有效降低副作用。

目前已有大量從細胞及動物水平上研究關于維生素D₃或者染料木素對骨質疏松癥的影響。維生素D₃及染料木素在促進成骨細胞的分化過程中存在協(xié)同作用，協(xié)同誘導成骨細胞活化并阻止破骨細胞的分化。適當劑量的染料木素與鈣和維生素D₃結合被視為預防和管理骨質流失的一種新的潛在療法。

本文在細胞水平上驗證維生素D₃和染料木素對治療骨質疏松癥的協(xié)同作用，并研究維生素D₃和染料木素在破骨細胞形成中的作用，為通過維生素D₃治療骨質疏松癥提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細胞RAW264.7、人成骨肉瘤細胞MG-63，均購自中國科學院上海細胞庫。

DMEM培養(yǎng)基（無酚紅）、Trizol試劑、胰蛋白酶，上海生工生物有限公司；Western及IP細胞裂解液，碧云天生物技術；染料木素、維生素D₃，維克奇生物技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma-Aldrich公司；抗壞血酸、茜素紅S染色液（1%，pH4.2）、西吡氯銨（CPC）、β-甘油磷酸鈉，北京索萊寶科技有限公司；核因子κB受體活化因子（RANKL），美國ROCKLAND公司；胎牛血清（FBS），NQBB；抗酒石酸酸性磷酸酶染液、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒，南京建成生物工程研究所；噻唑藍（MTT）、瓊脂糖，美國Invitrogen有限公司。

1.2 儀器與設備

全自動凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司；IX71熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Flash全波長掃描熒光酶標儀、7500RealTimePCRSys-tem，美國賽默飛公司；垂直層流潔凈工作臺，上海凈化設備有限公司；Heracell150二氧化碳培養(yǎng)箱、BiofugeStratos冷凍離心機，美國賽默飛公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

人成骨肉瘤細胞MG-63和小鼠巨噬細胞RAW264.7均在5%CO₂、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無酚紅DMEM培養(yǎng)基。

1.3.2 MTT法測定細胞增殖

取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期人成骨肉瘤細胞MG-63或者小鼠巨噬細胞RAW264.7，以每孔5×10³個接種于96孔板中。待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的染料木素、維生素D₃，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。藥物作用一定時間后吸除96孔板中的培養(yǎng)基，在37℃環(huán)境下，每孔用100μLMTT溶液（0.5mg/mL）孵育4h。小心吸除孵育后的MTT溶液，每孔用100μLDMSO溶解紫色結晶甲瓚，輕柔混勻。使用酶標儀以630nm波長處的A值作為參照，檢測570nm波長處的吸光度A值。

1.3.3 堿性磷酸酶（ALP）活性測定

人成骨肉瘤細胞MG-63以每孔2×10⁵個接種于6孔板，待細胞貼壁后，給藥組添加不同濃度的藥物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間。檢測時用PBS洗2遍，每孔加入150μL的細胞裂解液裂解細胞，置冰上30min后，4℃下離心15min，轉速為14000r/min，吸取上清液置于冰上，測定ALP活性嚴格按照ALP試劑盒說明書操作，檢測波長520nm。

1.3.4 茜素紅染色鑒定骨礦化

人成骨肉瘤細胞MG-63以每孔2×10⁵個接種于6孔板，待細胞貼壁后，礦化組和給藥組均換用含50μmol/L抗壞血酸和10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，給藥操作同1.3.3節(jié)。每天觀察細胞狀態(tài)，每1～2d更換培養(yǎng)基1次。21d后在倒置顯微鏡下觀察，部分細胞成片積累生長，出現(xiàn)形狀各異的“黑斑”，即為礦化結節(jié)。PBS清洗細胞2遍晾干，95%乙醇固定10min，蒸餾水清洗后晾干。加入茜素紅S染色液（1%，pH4.2），37℃染色60min。蒸餾水清洗2～3遍將未結合的染料洗掉，動作輕柔避免洗掉細胞，晾干后倒置顯微鏡下拍照并記錄。每孔加1mL10%CPC溶液充分溶解深紅色化合物，測定其在550nm下A值，鈣結節(jié)的量與A值的大小成正比，以定量鈣沉積情況。

1.3.5 誘導破骨細胞

小鼠巨噬細胞RAW264.7，以1×10⁴/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后，加入含50ng/mLRANKL誘導劑的培養(yǎng)基誘導破骨細胞生成。誘導6d后在倒置顯微鏡下可觀察到有多核細胞的形成，根據(jù)抗酒石酸酸性磷酸酶染液說明進行染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。記錄到含有大于3個細胞核的TRAP陽性多核細胞為破骨細胞。

1.3.6 破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性檢測

小鼠巨噬細胞RAW264.7以每孔5×10³個接種于6孔板中，每孔2.5mL。細胞貼壁后，給藥組和對照組均用含RANKL誘導劑（50ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，給藥組加入不同濃度的不同藥物。每1～2d更換培養(yǎng)基1次，培養(yǎng)6d。處理結束后，收集細胞，PBS洗1～2遍，每孔加入150μL的細胞裂解液裂解細胞，置冰上30min后，在4℃下離心15min，轉速為14000r/min，取上清液為總蛋白置于冰上，測定TRAP活性嚴格按照TRAP試劑盒說明書操作，檢測波長530nm。

1.3.7 人成骨肉瘤細胞MG-63的RNA提取及RT-PCR

MG-63細胞以每孔1×10⁵個接種于6cm培養(yǎng)板，細胞貼壁后加入藥物（分組及給藥情況同1.3.3節(jié)）。培養(yǎng)24h后收集細胞。用Trizol提取總RNA進行RT-PCR擴增。PCR擴增反應條件：采用兩步PCR反應程序法，第一步預變性95℃、30s；第二步PCR反應，95℃、5s，60℃、34s，循環(huán)40次。目的基因mRNA水平以與參照基因GAPDH的Tm比值表示。PCR引物序列如表1所示。