雞蛋富含多種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，是人們餐桌上常見的蛋白質(zhì)來源。蛋白質(zhì)主要分布在蛋清和蛋黃中，蛋清中蛋白以卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵黏蛋白以及伴白蛋白等形式存在；蛋黃中蛋白以高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和肝素等形式存在。研究表明，雞蛋中多種蛋白具有抗氧化活性，其中，卵白蛋白作為蛋清蛋白的主要成分，約占54%，是一種由385個氨基酸組成的糖蛋白，含有6個具有二硫鍵的半胱氨酸殘基，是唯一含有游離硫醇基團（SH）的蛋清蛋白，因而卵白蛋白能與自由基直接反應，從而具有較強的抗氧化活性。Liu等為改善姜黃素的功能特性，利用卵白蛋白制成卵白蛋白-姜黃素復合物，與純姜黃素相比，復合物的抗氧化活性提高。

目前對卵白蛋白抗氧化性的研究主要集中在酶解或改性前、后體外活性評價。卵白蛋白最終對人體的健康益處與其在體內(nèi)的生物利用度密切相關。評價生物利用度有體內(nèi)和體外兩類模型，體內(nèi)主要是動物模型。動物模型雖然能夠真實地還原生理條件下的消化過程，但是存在以下問題：實驗周期長，成本高，并且由于個體差異問題，容易造成結(jié)果的重復性差。評價卵白蛋白生物利用度的體外模型主要是體外模擬胃腸道消化模型，體外模擬消化能夠在一定程度上模擬生理狀況，并且試驗易操作，成本低、周期短。

本試驗以卵白蛋白及其體外模擬胃腸道消化產(chǎn)物為研究對象，探究卵白蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后的抗氧化活性變化。測定其ABTS⁺·清除活性和ORAC，評價體外抗氧化活性。利用H₂O₂誘導Caco-2細胞氧化損傷，構(gòu)建細胞氧化損傷模型，探究其體內(nèi)抗氧化活性。以期闡明卵白蛋白經(jīng)體外模擬胃腸道消化后抗氧化活性變化規(guī)律，為后續(xù)研究蛋白及其產(chǎn)物在體內(nèi)消化、吸收提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白、6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）、2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2，2’-azino-bis（3-ethylbenzoth-iazoline-6-sulfonicacid），ABTS）、2，2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2，2’-azobis（2-methylpropi-onamidine）dihydrochloride，AAPH）、熒光素鈉、細胞內(nèi)ROS檢測試劑盒等，美國Sigma公司；合成肽CFDV、CVSP、MPFR（純度＞95%），生工生物工程（上海）股份有限公司；人結(jié)腸癌細胞（Caco-2），中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；H2O2（分析純），北京化工廠；細胞增殖檢測試劑盒（MTS），美國Promega公司。

1.2 儀器與設備

電子天平，瑞士METTLERTOLEDO公司；多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；黑色孔板（透明平底），德國GreinerBio-One公司；移液器，德國Eppendorf公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，上海力申科學儀器有限公司；低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；倒置生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限公司；EASY-nLC1000液相色譜儀，美國ThermoScientific公司；OrbitrapEliteTM組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀，美國ThermoScientific公司。

1.3 方法

1.3.1 體外模擬胃腸道消化

參照Alting等報道的方法并稍作修改。稱取10g卵白蛋白，加入1L蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)1%的蛋白溶液。加質(zhì)量分數(shù)2%的胃蛋白酶（EC3.4.23.1，來源于豬胃黏膜，酶活力為3000units），用1mol/L的HCl將pH值調(diào)至2，保持體系溫度在37℃，持續(xù)酶解90min。用1mol/L的NaOH調(diào)pH值至7，加入質(zhì)量分數(shù)4%的胰液（EC3.4.21.4，來源于豬胰腺，酶活力為250units），保持溫度37℃和pH7，持續(xù)酶解4h。將體系沸水浴10min滅活蛋白酶，冷卻至室溫。將酶解液離心，在4℃下10000r/min離心10min，收集上清液，-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物體外抗氧化活性測定

1.3.2.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物ABTS⁺·清除能力測定

配制7mmol/LABTS溶液和4.9mmol/L的K₂S₂O₈溶液，將二者等體積混合配置得到ABTS儲備液。將儲備液于室溫避光條件下靜置12～16h后，用PBS將儲備液稀釋20～30倍，使其在734nm下的吸光度為0.7±0.02，形成ABTS工作液。96孔板按如下設置加入溶液：空白組：200μLPBS、對照組180μLABTS工作液和20μLPBS以及試驗組：180μLABTS工作液和20μL樣品溶液（0.5，1，5和10μg/mL），每組3個復孔。將96孔板放入酶標儀中，振蕩10s后，室溫靜置5min后，測定反應體系在734nm下的吸光度值。計算ABTS自由基清除能力（%）的公式為：

式中：A₀—空白組的吸光度；A₁—對照組的吸光度；A₂—試驗組的吸光度。

樣品的ABTS自由基清除能力用Trolox抗氧化當量（TEAC，μmol/LTE/g樣品）表示，即一定濃度的樣品溶液相當于多少濃度的Trolox溶液。

1.3.2.2 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物ORAC測定

配制116nmol/L的熒光素鈉溶液和40mmol/L的AAPH溶液。在黑色96孔板中首先按如下設置加入溶液，空白組：120μL熒光素鈉溶液和20μLPBS；樣品組：120μL熒光素鈉溶液和20μL樣品溶液（10μg/mL）；Trolox組（標準品組）：120μL熒光素鈉溶液和20μLTrolox溶液（1μg/mL），混合上述體系，在37℃下預熱2min后，快速加入60μLAAPH溶液啟動反應。將黑色96孔板立即放入酶標儀中，設置溫度37℃，激發(fā)波長485nm，發(fā)射波長520nm，每隔2min振板10s并檢測1次，連續(xù)測定600min。將每次測定值連成曲線，按下述公式計算熒光曲線下的面積：

式中：f₀—0min時的測定值；f_i—i，min時的測定值。Net，AUC按下述公式計算：

1.3.3 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的細胞抗氧化活性

1.3.3.1 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物的毒性作用

Caco-2細胞按照參考文獻的方法進行培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞以2×10⁴cells/孔的密度接種于96孔板中，分別設置空白組、對照組和試驗組，每個濃度6個復孔?？瞻捉M加入80μL的培養(yǎng)基，試驗組和對照組加入80μL細胞懸液，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育12h后，空白組和對照組加入10μLDMEM無血清高糖培養(yǎng)基，試驗組分別加入10μL終質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1mg/mL的樣品溶液，繼續(xù)孵育12h后，各組均加入10μLDMEM無血清高糖培養(yǎng)基，孵育6h后，利用MTS法測定細胞存活率。

1.3.3.2 H₂O₂誘導Caco-2細胞氧化損傷模型的建立

Caco-2細胞按照參考文獻的方法進行培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞以2×10⁴細胞/孔的密度接種于96孔板中，分別設置空白組、對照組和試驗組，每個濃度6個復孔。空白組加入80μL的培養(yǎng)基，試驗組和對照組加入80μL細胞懸液，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育12h后，各組均加入10μLDMEM無血清高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育12h后，空白組和對照組加入10μLDMEM無血清高糖培養(yǎng)基，試驗組分別加入10μL終濃度為400，500，600，700，800，900μmol/L的H₂O₂溶液，孵育6h后，利用MTS法測定細胞存活率。選取細胞存活率50%所對應的H₂O₂濃度為構(gòu)建Caco-2細胞氧化損傷模型的最佳濃度。

1.3.3.3 卵白蛋白及其消化產(chǎn)物對Caco-2細胞氧化損傷的保護作用

Caco-2細胞按照參考文獻的方法進行培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的Caco-2細胞以2×10⁴細胞/孔的密度接種于96孔板中，分別設置空白組、對照組和試驗組，每個濃度6個復孔?？瞻捉M加入80μL的培養(yǎng)基，試驗組和對照組加入80μL細胞懸液，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育12h后，空白組和對照組加入10μLDMEM無血清高糖培養(yǎng)基，試驗組分別加入10μL終質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1mg/mL的樣品溶液，繼續(xù)孵育12h后，空白組和對照組加入10μLDMEM無血清高糖培養(yǎng)基，試驗組加入10μL終濃度為700μmol/L的H₂O₂溶液，孵育6h后，利用MTS法測定細胞存活率。

相關鏈接：6-羥基-2，胃蛋白酶，熒光素，白蛋白

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