乳酸菌是一類GRAS（GenerallyRegardedAsSafety）級(jí)食品微生物，已廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品，可發(fā)揮抗菌、防腐，賦予食品特殊風(fēng)味以及提高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)等功能。目前，用于生產(chǎn)發(fā)酵食品的乳酸菌大概有20余種，如：保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌用于生產(chǎn)酸奶，德式乳桿菌用于發(fā)酵畜產(chǎn)品，干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌用于生產(chǎn)乳酪等，植物乳桿菌是酸菜發(fā)酵生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)菌株。以上這些傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵食品各自具有獨(dú)特的風(fēng)味，深受消費(fèi)者青睞。

豆?jié){是一類通常以大豆為原材料制成的傳統(tǒng)植物蛋白飲料，在豆?jié){的基礎(chǔ)上經(jīng)乳酸菌等菌株發(fā)酵可制成發(fā)酵豆?jié){。與傳統(tǒng)豆?jié){相比，發(fā)酵豆?jié){中的大豆蛋白能被分解為氨基酸和寡肽，更易于人體的吸收，同時(shí)破壞豆?jié){中的凝血素、胰蛋白酶抑制劑、脹氣因子等抗?fàn)I養(yǎng)因子。此外，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵，發(fā)酵豆?jié){被重新賦予新的風(fēng)味。其中，揮發(fā)性香氣成分的增加或生成是發(fā)酵豆?jié){提升感官品質(zhì)的重要因素。固相微萃取技術(shù)（SPME）是一種無溶劑樣品前處理技術(shù)，具有高效、便捷、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，與GC-MS技術(shù)相結(jié)合被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中揮發(fā)性氣味物質(zhì)的定性、定量分析。相關(guān)研究已有大量報(bào)道。樊艷等采用基于電子舌與SPME-GC-MS技術(shù)檢測(cè)分析了腐乳中的風(fēng)味物質(zhì)；王丹等采用SPME-GC-MS技術(shù)分析嗜熱鏈球菌IMAU10638發(fā)酵乳貯藏期間的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化；馬艷麗等基于SPME-GC-MS技術(shù)比較4種傳統(tǒng)中式酸凝奶酪與西方切達(dá)奶酪中揮發(fā)性風(fēng)味組分的差別。基于SPME-GC-MS技術(shù)分析發(fā)酵食品中特征性風(fēng)味物質(zhì)的組成及產(chǎn)生規(guī)律，對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)調(diào)控和改善具有重要意義。

目前，針對(duì)乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質(zhì)組成和特征香氣物質(zhì)分析的研究較少。本研究選擇在發(fā)酵食品中應(yīng)用廣泛的5種乳酸菌：植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）、干酪乳桿菌（Lac-tobacilluscasei）、德式乳桿菌（Lactobacillusger-mani）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillusfermentum）和嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）生產(chǎn)發(fā)酵豆?jié){，并對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵豆?jié){揮發(fā)性氣味物質(zhì)的組成與差異性進(jìn)行分析，旨在為乳酸菌發(fā)酵豆?jié){飲料的開發(fā)與生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆?jié){粉購于永和食品（中國(guó)）股份有限公司；純凈水，華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司；2-辛醇（分析純），美國(guó)Sigma-Aldrich公司；植物乳桿菌FZU122、干酪乳桿菌FJAT-7928、德式乳桿菌FJAT-46740、發(fā)酵乳桿菌FJAT-46744、嗜熱鏈球菌FJAT-46738，福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院保藏。

1.2 培養(yǎng)基的配制

MRS培養(yǎng)基：分別稱取牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母提取物5g、蛋白胨10g、磷酸氫鉀2g、無水乙酸鈉5g、硫酸錳0.25g、檸檬酸氫二銨2g、吐溫-801mL、硫酸鎂0.5g溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)pH值至6.2，121℃高壓滅菌20min。生理鹽水：稱取8～9gNaCl固體，溶解于1000mL去離子水中，121℃高壓滅菌20min。

1.3 儀器與設(shè)備

紫外-可見分光光度計(jì)（UV-1100型），上海美普達(dá)儀器有限公司；數(shù)顯pH計(jì)（MP511），上海三信儀表廠；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（5977A），美國(guó)安捷倫科技有限公司；固相微萃取萃取頭，PDMS30μm，美國(guó)Supelco公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣柄（57330-U），美國(guó)Supelco公司；恒溫生化培養(yǎng)箱（SPX-150BIII），黃驊菲斯福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；立式高壓滅菌鍋（LDZF-50L-III），上海申安醫(yī)療器械廠；理化分析型超純水機(jī)（WP-UP-LH-20），四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；分析電子天平（HZK-FA2105），美國(guó)康州HZ電子科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)（Fresco17），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；電磁攪拌器（OMS-181E），上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 豆?jié){的制備

稱取一定量豆?jié){粉，以10%的比例（質(zhì)量比）溶解于純凈水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，分裝至200mL絲口瓶，121℃高壓滅菌20min，待用。

1.4.2 菌株活化與接種

5種乳酸菌包括：植物乳桿菌FZU122、干酪乳桿菌FJAT-7928、德式乳桿菌FJAT-46740、發(fā)酵乳桿菌FJAT-46744、嗜熱鏈球菌FJAT-46738，由甘油管分別接種至MRS液體培養(yǎng)基37℃靜置培養(yǎng)，經(jīng)活化、轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，取一定量菌液離心，去除上清液，用生理鹽水洗滌3次。以生理鹽水作參比溶液，將菌液吸光度（OD_600nm）調(diào)至0.5～0.6。分別以1%的接菌量接種至100mL無菌豆?jié){，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)立3個(gè)平行樣，同時(shí)設(shè)立未發(fā)酵豆?jié){對(duì)照組，置恒溫生化培養(yǎng)箱37℃條件下靜置發(fā)酵60h。

1.4.3 pH值的測(cè)定

MRS液體培養(yǎng)基和豆?jié){經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后，取樣，用pH計(jì)測(cè)定不同乳酸菌發(fā)酵樣品的pH值，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行樣。1.4.4頂空固相微萃取取5mL樣品置12mL頂空萃取瓶中，加入1gNaCl、磁力轉(zhuǎn)子和10μL2-辛醇（10mg/L，內(nèi)標(biāo)物），用密封墊迅速密封樣品瓶，置磁力攪拌器加熱臺(tái)上，攪拌速度600r/min，40℃水浴溫育20min后插入固相微萃取針，壓出萃取纖維，使其固定在距離液面0.5～1.0cm處，吸附萃取30min后收回萃取纖維，拔出萃取針，插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)樣分析。

1.4.4 頂空固相微萃取

取5mL樣品置12mL頂空萃取瓶中，加入1gNaCl、磁力轉(zhuǎn)子和10μL2-辛醇（10mg/L，內(nèi)標(biāo)物），用密封墊迅速密封樣品瓶，置磁力攪拌器加熱臺(tái)上，攪拌速度600r/min，40℃水浴溫育20min后插入固相微萃取針，壓出萃取纖維，使其固定在距離液面0.5～1.0cm處，吸附萃取30min后收回萃取纖維，拔出萃取針，插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中進(jìn)樣分析。

1.4.5 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析條件：采用DB-WAX色譜柱（30m×0.25mm，0.25μm），進(jìn)樣口溫度250℃；柱溫箱起始溫度40℃，保留8min，然后以4℃/min升溫至150℃，再以20℃/min升溫至250℃，保留5min；不分流進(jìn)樣，載氣為99.999%高純度氦氣，載氣流速1mL/min。質(zhì)譜條件：離子源溫度230℃，電離方式為EI，電離能量70eV，接口溫度250℃，四級(jí)桿溫度150℃，選擇SCAN模式為掃描方式，定性分析，離子碎片的掃描范圍為30～500m/z，溶劑延遲時(shí)間2.5min。

1.4.6 揮發(fā)性成分的定量分析

選擇匹配度≥70，采用內(nèi)標(biāo)法定量分析。將10μL質(zhì)量濃度為10mg/mL的2-辛醇和5mL待測(cè)樣品混合均勻，對(duì)含有內(nèi)標(biāo)物的樣品通過GC-MS進(jìn)行分析。根據(jù)待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)物的峰面積，計(jì)算待測(cè)組分在樣品中的含量。

揮發(fā)性成分含量（mg/L）=

1.4.7 數(shù)據(jù)處理分析

運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用STAMP軟件比較組間物質(zhì)差異，利用Heml軟件繪制熱圖，應(yīng)用SIMCA14.1軟件進(jìn)行主成分分析，使用Origin8.5軟件和GraphPad6軟件繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次測(cè)定的平均值。

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