白酒和黃酒中生物胺的高效液相色譜分析法（一）

發(fā)布時(shí)間：2021-08-10 16:41 編輯者：特邀作者周世紅

黃酒屬于釀造酒，酒度一般為15°左右，在世界三大釀造酒（黃酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要的一席。它是以稻米、黍米、黑米、玉米、小麥等為原料，經(jīng)過蒸料，拌以麥曲、米曲或酒藥，進(jìn)行糖化和發(fā)酵釀制而成。黃酒含有豐富的營養(yǎng)，有“液體蛋糕”之稱，它含有眾多生物活性成分，如酚類物質(zhì)和谷胱甘肽等，能夠?qū)θ梭w起到清除自由基，延緩衰老，抑制腫瘤等的生理作用。白酒是中國的國酒，有著2000多年的歷史，是一種酒精含量在38%～65%之間的澄清、透明的發(fā)酵酒精飲料，通常由高粱或玉米、大米、小麥、豌豆、小米和高粱混合制成。白酒是一種著名的蒸餾酒，其生產(chǎn)工藝不同于其它蒸餾酒，它結(jié)合了兩種獨(dú)特的發(fā)酵和蒸餾過程，即在發(fā)酵過程中，淀粉轉(zhuǎn)化為糖與糖轉(zhuǎn)化為酒精兩個(gè)過程是同時(shí)進(jìn)行的。白酒中含有豐富的風(fēng)味成分，包括有機(jī)酸、酯、內(nèi)酯、酚類、雜環(huán)、萜類和芳香族化合物。此外，白酒還含有氨基酸和多肽等對人體有益的潛在功能成分。

等對人體有益的潛在功能成分。酒中富含氨基酸，而氨基酸是生物胺的前體物。發(fā)酵過程復(fù)雜且難以控制，易產(chǎn)生潛在有害物質(zhì)—生物胺。生物胺（Biogenicamine,BA）是在酒和發(fā)酵食品中經(jīng)常檢測到的一類具有生物活性、低分子質(zhì)量的含氮化合物，對人體有不利影響。氨基酸含量被認(rèn)為是葡萄酒釀造過程中生物胺形成的主要原因。食品中常見的生物胺主要有：組胺、色胺等雜環(huán)胺，酪胺、苯乙胺等芳香族胺，腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等脂肪族胺。其中，組胺和酪胺是食品中對人體影響最大的兩種生物胺，分別由組氨酸和酪氨酸脫羧形成。適度攝入生物胺對人體健康起到促進(jìn)作用，而攝入過量生物胺在人體蓄積會(huì)引起許多不適癥狀，如頭疼、嘔吐等。過量攝入酪胺還會(huì)引起邊緣血管收縮，導(dǎo)致機(jī)體心律變快、呼吸增強(qiáng)，同時(shí)降低體內(nèi)去甲腎上腺素水平含量。超過100mg會(huì)引起偏頭痛，超過1080mg會(huì)引起嚴(yán)重中毒。組胺的過量攝入會(huì)增加腎上腺素和去甲腎上腺素的釋放，并刺激運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和感覺神經(jīng)，引起過敏和高血壓。組胺是葡萄酒中常見的一種生物胺，不同國家對其限定標(biāo)準(zhǔn)各不相同，其中以德國標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，規(guī)定不得高于2mg/L。歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100mg/kｇ，酪胺含量不得超過100～800mg/kｇ。目前，酒中生物胺含量的檢測方法有多種，如毛細(xì)管電泳法（Capillaryelectrophoresis,CE）、高效液相色譜法（Highperformanceliquidchromatography,HPLC）、生物傳感器法（Biosensormethod）、薄層色譜法（Thinlayerchromatography，TLC）等。其中HPLＣ法實(shí)際應(yīng)用最為廣泛。HPLＣ儀能夠同時(shí)分析多個(gè)目標(biāo)物，分析速度快且準(zhǔn)確性高，因而在生物胺的檢測中應(yīng)用最多。由于生物胺沒有共軛特征結(jié)構(gòu)，在紫外檢測器上響應(yīng)較弱，所以對其進(jìn)行柱前衍生，使其產(chǎn)生紫外和熒光吸收。常用的衍生試劑主要有鄰苯二醛（OPA）、丹磺酰氯（Dns-C1）、二硝基苯甲酰氯（DABS-C1）、苯甲酰氯（Benzoylchloride）。丹磺酰氯是最為常用的衍生試劑，其衍生物相對穩(wěn)定，在避光條件下可穩(wěn)定存放12～14ｈ。試驗(yàn)中通過丹磺酰氯柱前衍生-HPLC法對黃酒與白酒中生物胺進(jìn)行檢測與比較。

一、材料與方法

1、材料與試劑

山西代縣黃酒與內(nèi)蒙草原王白酒系列均來自于當(dāng)?shù)仄髽I(yè)；9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：色胺（CAS號(hào)：61-54-1）、β-苯乙胺（CAS號(hào)：64-04-0）、腐胺（CAS號(hào)：110-60-1）、尸胺（CAS號(hào)：462-94-2）、鹽酸吡哆胺（CAS號(hào)：524-36-7）、組胺（CAS號(hào)：51-45-6）、酪胺（CAS號(hào)：51-67-2）、亞精胺（CAS號(hào)：124-20-9）、精胺（CAS號(hào)：71-44-3），上海源葉生物科技有限公司；丹磺酰氯（CAS號(hào)：605-65-2），上海麥克林生化科技有限公司；飽和碳酸氫鈉、氯化鈉、甲酸、正丁醇，西隴化工股份有限公司；乙酸銨，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；丙酮（分析純）、三氯甲烷（分析純），北京化工廠；乙醚（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2、儀器、設(shè)備

LC-20ATHPLC儀，日本島津公司；MX-Ｆ渦旋振蕩器，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UGC24M氮吹儀，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；VELOCITY18R大容量冷凍離心機(jī)，澳大利亞Dy-namica公司；實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，奧豪斯儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋，山東甄城華魯電熱儀器有限公司；WaterPro超純水系統(tǒng)，美國Labconco公司；ME104/02電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；0.22μm濾膜針頭濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

3、方法

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，以0.1mol/L稀鹽酸為溶劑，配制質(zhì)量濃度為1000mg/L的生物胺單體標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確量取不同體積的儲(chǔ)備液，稀釋，配制成終質(zhì)量濃度分別為50.00，25.00，5.00，1.00，0.50，0.25，0.20，0.10，0.05mg/L的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。以上所配溶液于4℃冰箱避光存放，保存期為2周。

（2）樣品的萃取與衍生

量取酒樣10.00mL，向其中加入適量氯化鈉至飽和。準(zhǔn)確量取上層試樣5.00mL，置于15mL離心管中，逐滴加入4～7滴5mol/L氫氧化鈉溶液，將溶液pH值調(diào)至11.5～12.0范圍。加入正丁醇-三氯甲烷（體積比1∶1）混合溶液5.0mL，充分均勻混合后4000ｒ/min離心10min。吸取并保留上層有機(jī)相，重復(fù)操作兩次，合并提取液。取3.0mL提取液，加入0.2mL1mol/L鹽酸，充分混合后吸取2mL溶液，在40℃條件下氮?dú)獯蹈?，然后加?.0mL0.1mol/L鹽酸，充分溶解提取物，待衍生。將上述提取液（1mL）置于15mL塑料離心管中，依次加入1mL飽和碳酸氫鈉溶液、100μL氫氧化鈉溶液（1mol/L）、1mL丹磺酰氯衍生試劑（10mg/mL丙酮為溶劑），渦旋振蕩60ｓ后置于60℃水浴環(huán)境中衍生，15min后取出，加入100μL谷氨酸鈉溶液（50mg/mL飽和碳酸氫鈉為溶劑）終止衍生。將上述混合物振蕩混勻后，在60℃條件下繼續(xù)反應(yīng)15min，取出冷卻至室溫，向其中加入1mL超純水，旋渦振蕩1min后混勻，置于40℃低溫水浴環(huán)境下氮吹除去有機(jī)溶劑（約1mL），加入0.5ｇ氯化鈉，待溶解后繼續(xù)加入5mL有機(jī)溶劑乙醚，振蕩2min后靜置分層。將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)移至15mL玻璃試管中，水相（下層）再次萃取。將兩次萃取液合并后氮?dú)獯蹈桑尤霃?fù)溶液乙腈1mL，完全溶解后經(jīng)0.22μm針頭濾器過濾，冷藏待測。

（3）色譜條件

采用賽默飛HGOLDC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）分離，紫外檢測波長254ｎm，進(jìn)樣體積20μL，柱溫35℃，流動(dòng)相A為0.01mol/L乙酸銨溶液（含0.1%乙酸）-乙腈（9∶1，V/V），流動(dòng)相B為乙腈-0.01mol/L乙酸銨溶液（9∶1，V/V），流速0.8mL/min。見表1梯度洗脫程序1。