④放射免疫分析

放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是由Yalow R·S·和Berson S．A．于1954年創(chuàng)建的。該法利用放射性同位素(常用³H、¹²⁵I、³²P等)標(biāo)記抗原或抗體，通過檢測放射性強(qiáng)度對(duì)抗原或抗體進(jìn)行示蹤和檢測，具有檢測靈敏度高(檢測限達(dá)ng至pg甚至fg級(jí))、特異性強(qiáng)、簡便實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)。但放射性同位素標(biāo)記要在特殊的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，標(biāo)記較困難，標(biāo)記和分析中易造成放射性污染。此外，由于放射性元素有一定半衰期，易自行衰減且難以保存，檢測時(shí)需要特殊的儀器設(shè)備，在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用受到很大限制，甚至趨向于被淘汰。

2、酶免疫分析

酶免疫分析法(erzyme immunoassay，EIA)是Engrall等人于1966創(chuàng)建的。該法用特定的酶(如過氧化物酶、堿性磷酸酯酶等)來標(biāo)記抗原或抗體，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化顯色反應(yīng)的高效性對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行示蹤和檢測。常用酶免疫分析包括酶抑制法(erlzynle inhibition，EI)、酶放大免疫檢測法(enzyme—multipledimmlmoassay techniqtle，EMIT)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。

(1)酶抑制法：此法利用特定的酶標(biāo)記抗原或抗體，酶標(biāo)記物在形成抗原抗體復(fù)合物時(shí)，酶活性降低，通過測定酶活性的變化對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測。酶抑制法是一種均相免疫分析方法，方法簡便，既可以用于檢測抗體，也可以用于檢測抗原，但其靈敏度較低。

(2)酶放大免疫檢測法：此法將酶標(biāo)記農(nóng)藥半抗原、待測農(nóng)藥及抗體加入反應(yīng)管進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)，離心去除結(jié)合物，上清液中剩余的酶標(biāo)農(nóng)藥半抗原量與待測農(nóng)藥含量呈正比。

在上清液中加入酶的底物和顯色劑，酶促顯色反應(yīng)強(qiáng)度與待測農(nóng)藥含量呈正比。酶放大免疫檢測法不用固相載體，重復(fù)性好，檢測速度快。

(3)酶聯(lián)免疫吸附測定法：酶聯(lián)免疫吸附測定法是將抗原抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合的一種敏感性很高的非均相免疫分析技術(shù)。將抗原或抗體固定于固相(如聚苯乙烯微孔板表面)，抗原抗體反應(yīng)平衡后，洗滌除去多余的游離物，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)記物催化底物反應(yīng)使顯色劑顯色，通過測定酶促顯色強(qiáng)度對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測。在實(shí)際應(yīng)用中，檢測大分子抗原多采用雙抗體夾心等非競爭模式。檢測農(nóng)藥、藥物等小分子采用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法、包被抗原直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法和包被抗體直接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定法。

目前已建立了多種有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等農(nóng)藥的酶聯(lián)免疫吸附測定法，有些已開發(fā)成商品化免疫檢測試劑盒。酶聯(lián)免疫吸附測定法是目前應(yīng)用最多的農(nóng)藥殘留免疫分析技術(shù)。

3、熒光免疫分析

熒光免疫分析(fluorescerlce immurtoassa3r，F(xiàn)IA)包括熒光標(biāo)記免疫分析和酶標(biāo)記熒光免疫分析。熒光標(biāo)記免疫分析是用特定的熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，利用抗原抗體反應(yīng)的特異性和熒光檢測的高敏感性對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行示蹤和檢測。經(jīng)典的熒光免疫分析以有機(jī)熒光分子為標(biāo)記物，常用的有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocya-nate，F(xiàn)ITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethyl rh(Marnine isothic)cyanate，TRITC)等。酶標(biāo)記熒光免疫分析是在酶標(biāo)記免疫分析中用熒光底物代替生色底物，是目前非放射免疫分析中靈敏度最高的方法之一。

熒光免疫分析具有靈敏度高、易標(biāo)記、好保存等優(yōu)點(diǎn)。但是大多數(shù)有機(jī)熒光物質(zhì)的熒光壽命短，在實(shí)際應(yīng)用中由于樣品、試劑的自身熒光和激發(fā)光的散射等因素，導(dǎo)致背景熒光高，影響了測定的可靠性和靈敏度。

(1)非競爭模式：熒光免疫分析法檢測抗體、顆粒性或大分子抗原通常采用非均相反應(yīng)和非競爭方式，檢測方法和原理如下。

①直接法：先固定待測物(含抗原或抗體的樣品)，加入熒光標(biāo)記抗體(或熒光標(biāo)記抗原)，進(jìn)行免疫反應(yīng)。洗滌去除游離物后進(jìn)行熒光檢測。如固相上結(jié)合了熒光標(biāo)記抗體(或熒光標(biāo)記抗原)，表明固相上有相應(yīng)的特異性抗原或特異性抗體存在，且熒光強(qiáng)度與相應(yīng)抗原或相應(yīng)抗體的量在一定范圍內(nèi)呈正比。

②雙抗體夾心法檢測抗原：先固定抗體，加入待測物進(jìn)行反應(yīng)。洗滌去除游離物后加入熒光標(biāo)記的第二抗體。洗滌去除游離物后進(jìn)行熒光檢測。如固相上結(jié)合了熒光標(biāo)記物，表明有相應(yīng)的特異性抗原存在，且熒光強(qiáng)度與待測抗原量在一定范圍內(nèi)呈正比。

(2)競爭模式：農(nóng)藥等小分子化合物的熒光免疫分析通常采用競爭模式，檢測方法和原理如下。

①熒光偏振免疫分析：熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immulaoassay，F(xiàn)PIA)是一種利用物質(zhì)分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度與分子質(zhì)量大小呈反比的特點(diǎn)檢測目標(biāo)分析物的方法。以適當(dāng)?shù)臒晒馕镔|(zhì)標(biāo)記農(nóng)藥半抗原，當(dāng)熒光標(biāo)記物受到一個(gè)平面偏振光照射時(shí)，如果分子的長軸與投入的偏振光面平行，吸收的偏振光最多，分子被激發(fā)。當(dāng)激發(fā)態(tài)分子回到基態(tài)時(shí)，發(fā)射一個(gè)偏振光。熒光標(biāo)記物在溶液中旋轉(zhuǎn)速度越快，發(fā)射的偏振光越弱。由于分子旋轉(zhuǎn)的速度與分子質(zhì)量大小呈反比，因而偏振光減弱的程度與分子旋轉(zhuǎn)的速度呈正比。當(dāng)熒光標(biāo)記農(nóng)藥與相應(yīng)抗體結(jié)合后，分子質(zhì)量顯著變大，旋轉(zhuǎn)速度明顯減慢，偏振光增強(qiáng)。當(dāng)待測溶液中有目標(biāo)分析農(nóng)藥存在時(shí)，目標(biāo)分析農(nóng)藥與熒光標(biāo)記農(nóng)藥競爭結(jié)合抗體，使熒光標(biāo)記農(nóng)藥與抗體的結(jié)合減少，偏振光減弱，減弱的程度與待測農(nóng)藥的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比。

②以熒光增強(qiáng)和熒光猝滅為基礎(chǔ)的免疫分析：該法利用抗原抗體反應(yīng)過程中熒光標(biāo)記物或熒光底物發(fā)生熒光增強(qiáng)或熒光猝滅作用來檢測抗原或抗體。

熒光偏振免疫分析、以熒光增強(qiáng)和熒光猝滅為基礎(chǔ)的免疫分析通常是均相免疫分析，方法簡便快速、經(jīng)濟(jì)安全，但背景的干擾限制了方法的靈敏度。

③時(shí)間分辨熒光免疫分析：時(shí)間分辨熒光免疫分析(tlmeresolution fluorescencc、immunoassav，TRFIA)以鑭系元素螯合物為熒光標(biāo)記物或熒光底物，利用標(biāo)記的TRFIA物或底物的熒光壽命較長的特點(diǎn)，在背景熒光消失后測定標(biāo)記物或底物的熒光強(qiáng)度，可有效降低背景熒光的干擾，顯著提高熒光免疫分析的靈敏度，是20世紀(jì)80年代免疫分析的一個(gè)重要突破。

4、化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光是利用化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的內(nèi)能激發(fā)化學(xué)發(fā)光劑(常用魯米諾及其衍生物)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析(chemilumirlescence lmmunoassay，CLIA)是把化學(xué)發(fā)光的高靈敏度與免疫分析的高選擇性結(jié)合起來的微量免疫分析技術(shù)，包括化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析、酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析(底物發(fā)光免疫分析)等。

(1)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析：化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析的原理和反應(yīng)模式與放射免疫分析基本相同，只是用化學(xué)發(fā)光劑代替同位素標(biāo)記抗原或抗體?；瘜W(xué)發(fā)光劑標(biāo)記的抗原或抗體與待測抗體或待測抗原反應(yīng)后經(jīng)分離、洗滌等步驟，最后通過測定發(fā)光強(qiáng)度來確定待測物的含量。

(2)酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析：酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析的原理和反應(yīng)模式與酶聯(lián)免疫吸附測定法基本相同，只是用化學(xué)發(fā)光劑代替顯色劑，以檢測化學(xué)發(fā)光代替比色測定。

化學(xué)發(fā)光免疫分析的檢測靈敏度可以與放射免疫分析媲美，方法簡便快速。目前，化學(xué)發(fā)光免疫分析存在的主要問題是被測樣品中其他物質(zhì)的背景干擾大，影響定量測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

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