1.2.5 pDNA的定值與不確定度分析

pDNA Listeria的特性值由8個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室用UV方法協(xié)同測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)統(tǒng)計(jì)檢查以確認(rèn)每組數(shù)據(jù)沒(méi)有異常值和顯著差異后，將8個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果平均值作為該pDNA標(biāo)準(zhǔn)品的特性值。進(jìn)而參考ISO指南35,根據(jù)公式(3)計(jì)算質(zhì)粒DNA在定值過(guò)程引入的不確定度(uq):

其中：s為總平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，p為實(shí)驗(yàn)室數(shù)目。

pDNA的不確定度由三部分組成，分別是：由于分裝過(guò)程中不均勻性引入的不確定度(uh)、長(zhǎng)期保存引入的不確定度(us)、定值過(guò)程引入的不確定度(uq)。按照公式(4)計(jì)算參考物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

計(jì)算擴(kuò)展不確定度時(shí)，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子(k,k=2)。所以，擴(kuò)展相對(duì)不確定度計(jì)按公式(5)計(jì)算：

1.2.6 qPCR試驗(yàn)

分別對(duì)pDNA和從Listeria:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株中提取的gDNA通過(guò)A260進(jìn)行定量。根據(jù)單增李斯特菌基因組大小2.90 Mbp估算gDNA的拷貝數(shù)，并基于4 271 bp估算pDNA Listeria的拷貝數(shù)。公式(6)用于計(jì)算每微升質(zhì)粒DNA和基因組DNA(gDNA)的拷貝數(shù)。

定量完成后，分別使用2×106～2×101拷貝/L的pDNA Listeria和gDNA制備10倍稀釋系列濃度樣品用于進(jìn)行qPCR檢測(cè)。qPCR分析使用ABI SYBR FAST qPCR Master Mix(2×),在八聯(lián)管中以25μL體積進(jìn)行PCR反應(yīng)(引物序列和擴(kuò)增子大小見(jiàn)表1),每個(gè)反應(yīng)均含10 pmol/L引物。PCR程序：95℃預(yù)變性10 min,95℃變性30 s,55℃退火45 s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。根據(jù)qPCR結(jié)果生成pDNA和gDNA的五點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0和Graphpad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均勻性測(cè)試使用單向方差分析。穩(wěn)定性分析使用單向線性回歸分析來(lái)計(jì)算斜率β1,當(dāng)|β1|

2結(jié)果

2.1質(zhì)粒構(gòu)建和pDNA Listeria純度鑒定

合成了含有hlyA、plcB、inlA基因的DNA片段，并將該片段插入克隆載體pUC57中，制備了重組質(zhì)粒pDNA Listeria(見(jiàn)圖1)。pDNA經(jīng)提取純化后，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，重組質(zhì)粒中插入片段的序列準(zhǔn)確度為100%,符合預(yù)期(見(jiàn)圖2)。同時(shí)pDNA的A260/A280比值為1.863±0.234,介于1.8～2.0之間，A260/A230的比值超過(guò)2.0,表明該pDNA溶液中無(wú)乙醇、蛋白質(zhì)或RNA污染。

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