核磁共振(NMR)作為一種重要波譜分析手段，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、食品以及材料科學(xué)等諸多學(xué)科領(lǐng)域。核磁共振波譜能提供復(fù)雜體系中分子結(jié)構(gòu)、相互作用、動(dòng)態(tài)過程和含量等大量信息，在藥學(xué)領(lǐng)域中發(fā)揮著十分重要的作用。本文綜述了近10年來核磁共振波譜技術(shù)在藥物發(fā)現(xiàn)、藥物和藥用輔料質(zhì)量控制、化學(xué)藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和藥物代謝研究等方面的應(yīng)用。

核磁共振（NMR）是自旋量子數(shù)不為零的原子核在外磁場作用下能級(jí)發(fā)生塞曼分裂，共振吸收某一特定頻率的射頻輻射，從低能態(tài)躍遷到高能態(tài)的物理過程。NMR就是利用該物理現(xiàn)象探測處于不同化學(xué)環(huán)境下的原子核而獲取的信息來研究物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、分子間相互作用等內(nèi)容的光譜學(xué)方法。自1946年美國斯坦福大學(xué)的Bloch和哈佛大學(xué)的Purcell領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)分別發(fā)現(xiàn)水和石蠟中的NMR信號(hào)之后，NMR技術(shù)在短短幾十年里得到快速的發(fā)展。最初的NMR儀器使用的是電磁鐵或永久磁鐵的連續(xù)波（CW),20世紀(jì)70年代Ernst發(fā)展了脈沖傅里葉變換（FT）的方法，將NMR儀器和技術(shù)推向一個(gè)新的高度，并于1991年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1985年，瑞士科學(xué)家Wüthrich教授將NMR應(yīng)用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析，從而推動(dòng)了NMR在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，Wüthrich也因此獲得2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。20世紀(jì)90年代，超高場NMR譜儀的問世，極大地提高了NMR檢測的靈敏度和分辨率，推動(dòng)NMR在各個(gè)領(lǐng)域更加廣泛的應(yīng)用。

NMR作為一種重要波譜分析手段，可深入探測物質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)而不破壞樣品，并具有準(zhǔn)確、快速和對(duì)復(fù)雜樣品不需要預(yù)處理就能進(jìn)行分析等特點(diǎn)。隨著磁場強(qiáng)度的提高，信號(hào)檢測（硬件和信號(hào)處理）、脈沖實(shí)驗(yàn)、自旋標(biāo)記等技術(shù)的進(jìn)步，困擾NMR低靈敏度的問題已大大改善。如今，NMR已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、食品以及材料科學(xué)等諸多學(xué)科領(lǐng)域，成為這些領(lǐng)域常規(guī)工作以及科學(xué)研究的有力工具，在某些領(lǐng)域甚至已經(jīng)成為一種不可或缺的分析與測量手段。本文綜述了NMR在藥物發(fā)現(xiàn)、藥物和藥用輔料質(zhì)量控制、藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和藥物代謝研究等方面的應(yīng)用，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行展望。

1 NMR在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

近20年來，得益于方法和儀器上的進(jìn)步，NMR已經(jīng)成為藥物發(fā)現(xiàn)的主要工具：可以為藥物發(fā)現(xiàn)提供許多重要信息，如結(jié)合位點(diǎn)的識(shí)別和確定、藥物設(shè)計(jì)等。基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)（fragment-based drug discovery,FBDD）是近年來發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物的主流方法之一，而NMR是第1個(gè)被成功應(yīng)用于片段篩選的技術(shù)。在藥物發(fā)現(xiàn)階段，利用NMR進(jìn)行活性化合物篩選的方法可以分為蛋白篩選法和配體篩選法。蛋白篩選法是通過配體小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合后，蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的局部化學(xué)環(huán)境會(huì)發(fā)生改變，檢測生物靶分子的化學(xué)位移的變化來實(shí)現(xiàn)的。其方法主要有核磁共振構(gòu)效關(guān)系（structure-activity relationship by NMR,SAR-by-NMR）研究法和基于G-四鏈體識(shí)別法。SAR-by-NMR方法是利用15N標(biāo)記的蛋白質(zhì)和15N-1H HSQC實(shí)驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)的。通過15N-1H HSQC譜中15N或1H的化學(xué)位移的變化可以檢測到是否有小分子和蛋白結(jié)合，同時(shí)配體和蛋白質(zhì)的結(jié)合常數(shù)可以通過化學(xué)位移的變化和配體濃度的關(guān)系測得，結(jié)合位點(diǎn)也可以由發(fā)生化學(xué)位移變化的原子核來確定?；贕-四鏈體的藥物篩選方法是在小分子配體中引入G-四鏈體，利用1H NMR譜中G-四鏈體亞氨基質(zhì)子化學(xué)位移的變化判斷與其結(jié)合配體的存在，利用擴(kuò)散譜（DOSY）對(duì)G-四鏈體配體進(jìn)行虛擬分離，利用異核單量子相關(guān)譜（HSQC）和異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）等二維譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，得到活性化合物的結(jié)構(gòu)。蛋白篩選法具有很好的穩(wěn)定性和靈敏度，但是需要對(duì)蛋白進(jìn)行大量的同位素標(biāo)記。配體篩選法主要是利用特定NMR技術(shù)篩選出與靶蛋白結(jié)合核磁譜圖發(fā)生變化的活性小分子。其篩選方法主要有2類：基于流體力學(xué)性質(zhì)（如擴(kuò)散和弛豫）變化的方法和基于矢量轉(zhuǎn)移的方法。前者是利用小分子與靶標(biāo)蛋白結(jié)合時(shí)NMR譜峰會(huì)變寬變?nèi)鮼磉M(jìn)行篩選，后者是通過選擇性照射蛋白質(zhì)的質(zhì)子，由于分子間相互作用磁化強(qiáng)度傳遞到與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子上，使其信號(hào)部分被飽和，利用照射前后核磁的差譜圖可以發(fā)現(xiàn)與蛋白結(jié)合的小分子。例如，Wan等利用配體篩選方法，在中藥何首烏初提物中加入與糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等代謝疾病相關(guān)的靶蛋白FABP4，通過檢測加入蛋白前后配體NMR信號(hào)變化，發(fā)現(xiàn)了活性分子2,4-二羥基-6-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（TSG）。配體篩選法不需要大量的蛋白，也不需要同位素標(biāo)記，一維NMR譜基本能完成，節(jié)省費(fèi)用和時(shí)間，但缺點(diǎn)是無法獲取配體與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的信息。

2 NMR在藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用

NMR在藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用主要包括活性藥物成分的定性鑒別、含量測定以及雜質(zhì)檢查等等。NMR集定性和定量測定于一體，在藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用日益廣泛?！吨腥A人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2010年版、《美國藥典》19版（1975年）、《英國藥典》1975年版、《歐洲藥典》第5版（2004年）和《日本藥局方》12版（1991年）就開始將NMR收載其中。目前，除《中國藥典》外，上述國家藥典均收載有利用NMR對(duì)藥物進(jìn)行質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)各論。

2.1藥物的定性鑒別

NMR能夠提供有機(jī)化合物豐富的結(jié)構(gòu)信息，是獲取有機(jī)分子結(jié)構(gòu)確鑿證據(jù)最常用的方法。既可以用于單一成分的結(jié)構(gòu)鑒定，也可以用于混合物的結(jié)構(gòu)鑒定。特別是一些復(fù)雜的聚合物類藥物，結(jié)構(gòu)中含有數(shù)目不定的重復(fù)單元和取代基，且結(jié)構(gòu)及性質(zhì)相似，常規(guī)的檢測方法難以對(duì)其精細(xì)化結(jié)構(gòu)細(xì)微差異進(jìn)行識(shí)別，從而無法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分，NMR譜圖與有機(jī)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，能準(zhǔn)確反映有機(jī)分子結(jié)構(gòu)差異，相對(duì)其他理化鑒別方法，NMR對(duì)于上述復(fù)雜成分的鑒別更具優(yōu)勢(shì)。低分子肝素主要是由未分級(jí)肝素（unfractional heparin,UFH）為原料，采用不同的降解工藝（自由基降解、亞硝酸降解、β-消除法和酶解法）降解得到的結(jié)構(gòu)不同的肝素衍生物。目前國內(nèi)外已有多種低分子肝素產(chǎn)品相繼問世，按照生產(chǎn)工藝的不同，常見的有依諾肝素鈉、達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉和汀肝素鈉等。分子結(jié)構(gòu)主要由2種糖醛酸（L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸）和1種葡萄糖胺以及它們的衍生物（乙?；⒘蛩峄┙M成的具有不同鏈長的多糖混合物。為了對(duì)不同低分子肝素品種進(jìn)行有效鑒別，現(xiàn)行的《美國藥典》、《歐洲藥典》、《英國藥典》等除利用分子量與分子量分布、抗Xa因子與抗Ⅱa因子效價(jià)比值鑒別外，還增加了核磁共振碳譜（13C NMR）（樣品與對(duì)照品的碳譜比較兩者相似）或氫譜（1H NMR）（樣品的氫譜在規(guī)定化學(xué)位移處出現(xiàn)特征峰信號(hào)）的方法進(jìn)行鑒別。此外，文獻(xiàn)也有利用NMR對(duì)不同低分子肝素品種進(jìn)行鑒別的報(bào)道。例如，張琪等通過比較依諾肝素鈉、達(dá)肝素鈉、那屈肝素鈣、帕肝素鈉和汀肝素鈉等5種低分子量肝素的13C NMR譜精細(xì)結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)不同類型低分子量肝素的特征碳譜信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行鑒別和區(qū)分。

2.2藥物的含量測定

早在1963年，Jungnickel和Hollis最早報(bào)道了定量核磁共振（q NMR）的應(yīng)用。由于q NMR在有機(jī)物含量測定方面具有諸多優(yōu)勢(shì)，譬如定量時(shí)定量峰面積只與它的原子數(shù)有關(guān)，因此不需要引進(jìn)任何校正因子；不需要待測物相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；供試溶液制備方便；實(shí)驗(yàn)操作簡單、分析速度快等等，因而q NMR在藥物含量測定方面得到越來越多的應(yīng)用。目前，q NMR用于定量最多的是定量1H、19F和31P NMR譜；定量方法有內(nèi)標(biāo)法（待測物和內(nèi)標(biāo)物同時(shí)置于同一核磁管中進(jìn)行測定）和外標(biāo)法（待測物和內(nèi)標(biāo)物分別置于2支核磁管分別測定），現(xiàn)在多使用內(nèi)標(biāo)法；定量模式分絕對(duì)定量和相對(duì)定量2種模式，前者采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，直接檢測待測樣品中的組分含量，后者是基于待測樣品中每個(gè)組分特征峰的積分值，檢測特定組分之間的相對(duì)含量。在藥物含量測定應(yīng)用過程中，對(duì)于分子結(jié)構(gòu)中無發(fā)色團(tuán)不具紫外吸收或者無相應(yīng)對(duì)照品的藥物含量測定，q NMR往往是一種非常適宜的方法。例如，阿侖磷酸鈉不具紫外吸收，分子極性大，采用滴定法專屬性不強(qiáng)，采用常規(guī)色譜定量方法則需要進(jìn)行柱前或者柱后衍生，測定過程復(fù)雜，操作煩瑣。Xie等采用定量核磁共振氫譜（q HNMR）法，以4-氨基丁酸作為定量內(nèi)標(biāo)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)阿侖磷酸鈉片中主成分含量的快速測定。Gadape等以DMSO-d6為溶劑，馬來酸為定量內(nèi)標(biāo)物，對(duì)卡維地洛的含量進(jìn)行測定，并將q NMR法與高效液相色譜（HPLC）法的測定結(jié)果比較，無顯著性差異，且前者定量準(zhǔn)確，無破壞性，適合卡維地洛的含量測定。q NMR作為一種定量方法使用日益廣泛，利用該法進(jìn)行含量測定時(shí)，除對(duì)影響定量準(zhǔn)確性的因素如樣品的稱量、待測物和內(nèi)標(biāo)物的濃度和定量峰的選擇、采集時(shí)間、掃描次數(shù)、弛豫延遲時(shí)間（D1）的設(shè)置等應(yīng)注意外，還應(yīng)對(duì)待測物與內(nèi)標(biāo)物是否發(fā)生反應(yīng)、定量峰是否包含有其他峰等因素加以關(guān)注。

2.3藥物雜質(zhì)的檢查

隨著公眾和媒體對(duì)藥物安全性的日益關(guān)注，對(duì)藥物中雜質(zhì)的控制已經(jīng)成為藥品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。藥品中諸雜質(zhì)的種類和含量被總稱為雜質(zhì)譜。反相高效液相色譜法是目前藥品雜質(zhì)譜分離分析的主要方法，隨著NMR技術(shù)的發(fā)展，NMR已經(jīng)成為解決雜質(zhì)譜定性和定量諸多挑戰(zhàn)的重要的有效工具。特別是NMR法可以對(duì)一些藥物的多種雜質(zhì)成分同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，而無需復(fù)雜的前期分離處理。液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）能夠?qū)﹄s質(zhì)混合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，但是存在有些情況下不能得到確切無疑的結(jié)構(gòu)信息，無法區(qū)分異構(gòu)體等缺點(diǎn)，此時(shí)NMR及其聯(lián)用技術(shù)能夠提供最全面的結(jié)構(gòu)信息，包括化合物的平面結(jié)構(gòu)、相對(duì)結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)，從而在雜質(zhì)分析方面發(fā)揮重要作用。此外，藥物研發(fā)的早期階段，藥物中雜質(zhì)往往沒有相應(yīng)的對(duì)照品、對(duì)照品的量有限、對(duì)照品的含量值不易測定等難點(diǎn)，這些因素會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)分析十分困難。由于NMR無需待測物對(duì)照品，因此特別適合藥物研發(fā)早期階段。特別是當(dāng)藥品中雜質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性藥物成分無直接相關(guān)或者雜質(zhì)結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜時(shí)，一般分析方法對(duì)其結(jié)構(gòu)鑒定較為困難，而NMR則往往能夠很好地予以解決。因此，對(duì)于藥品中雜質(zhì)分析，無論是定性還是定量方面，NMR都能夠發(fā)揮重要作用。2007年—2008年，歐美各國發(fā)生肝素鈉注射液由于多硫酸軟骨素（OSCS）污染導(dǎo)致上百人死亡的嚴(yán)重藥害事件，污染物OSCS結(jié)構(gòu)的最終確認(rèn)主要是通過一維NMR(1H和13C NMR）和二維NMR實(shí)現(xiàn)的。隨后，美國FDA將NMR作為肝素中OSCS污染物篩查的重要方法。羧甲司坦是一種祛痰藥，目前《歐洲藥典》中采用薄層色譜法（TLC）對(duì)其中氨基酸雜質(zhì)進(jìn)行檢測，其方法未能覆蓋其他類型雜質(zhì)如合成起始原料雜質(zhì)以及降解雜質(zhì)等，且方法靈敏度不高。Wahl等采用高效液相色譜電噴霧檢測器法（HPLC-CAD）、紫外-可見分光光度法和q NMR對(duì)羧甲司坦的雜質(zhì)譜進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羧甲司坦中揮發(fā)性雜質(zhì)氯乙酸不適合HPLC檢測，但采用q NMR能夠準(zhǔn)確測定其含量（0.09%），并且該法簡便快速。

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